大鼠循环血中血小板和内皮细胞来源微囊泡的检测*

张梦晓 尚 曼 张 琦 王 瑶 吴艳娜 宋君秋 刘艳霞

大鼠循环血中血小板和内皮细胞来源微囊泡的检测*

张梦晓 尚 曼 张 琦 王 瑶 吴艳娜 宋君秋 刘艳霞△

目的 建立流式细胞术对大鼠循环血中细胞微囊泡（MVs）的检测方法，并测定心肌缺血预适应（IPC）处理大鼠循环血中血小板来源的MVs（PMVs）及内皮细胞来源的MVs（EMVs）。方法大鼠经腹主动脉取血，枸橼酸钠抗凝，室温下经两步离心获得无血小板血浆（PFP）。PFP中分别加入FITC标记的血小板表面标志物CD61单抗或PE标记的内皮细胞表面标志物CD144单抗，采用1 μm标准微球做粒径对照，2 μm标准微球用于计数，流式细胞仪进行检测。结果3.5%枸橼酸钠与血液按体积比1∶4混匀，离心后可得均匀、清亮的上清。PFP中1 μm以下粒子信号占全部信号的99%以上。PMVs和EMVs分别为CD61阳性和CD144阳性的粒子，直径均小于1 μm。IPC处理大鼠循环血中PMVs、EMVs水平分别为（4 053±1 987）个/μL、（4 870±825）个/μL。结论成功建立和优化了流式细胞术测定大鼠循环血中MVs的方法，并通过对IPC处理大鼠循环血中PMVs和EMVs的测定对MVs的检测方法进行了验证。

血小板；内皮细胞；流式细胞术；大鼠,Wistar；细胞微囊泡；缺血预适应

细胞微囊泡（microvesicels,MVs）是细胞激活或凋亡时细胞表面释放的囊泡状结构，由脂质双层包裹，携带亲本细胞特异性表面标志物，内含细胞器、核酸、蛋白质等活性物质，直径小于1 μm[1]。循环血中血小板来源的MVs(platelet-derived MVs,PMVs)是血小板活化的标志，内皮细胞来源的MVs(endothelial cell-derived MVs,EMVs)可反映内皮功能。PMVs和EMVs数量和表型的改变与心绞痛、心肌梗死、糖尿病等多种疾病状态关系密切[2-4]，并对疾病的发生、发展和转归产生影响，但其作用机制尚不清楚。本研究以大鼠为研究对象，检测心肌缺血预适应（ischemic preconditioning,IPC）模型大鼠循环血中的PMVs和EMVs，采用荧光素标记的特异性抗体与标准微球相结合的手段，建立大鼠循环血中MVs的流式检测方法，为MVs相关基础研究提供方法学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。健康雄性Wistar大鼠，3～6个月龄，体质量220～250 g，清洁级，购自军事医学科学院卫生医学与环境研究所。（2）药品与试剂。枸橼酸钠（天津市光复科技发展有限公司），多聚甲醛（Boster immunoleader公司），1 μm和2 μm标准微球（Molecular Probe），FITC标记的抗大鼠CD61单抗及FITC标记的小鼠IgG1（BD公司），PE标记的抗大鼠CD144单抗及PE标记的小鼠IgG1（Santa Cruz公司）。（3）实验仪器。BL-420E生物功能实验系统及HX-100E型小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司），3-18K高速冷冻离心机（Sigma公司），FACS Calibur流式细胞仪（BD公司），HQ-60-Ⅱ涡旋混合器（北方同正公司）。

1.2 无血小板血浆（platelet-free plasma,PFP）的制备 分离暴露大鼠腹主动脉，用预先吸有0.5 mL 3.2%枸橼酸钠或1 mL 3.5%枸橼酸钠的5 mL注射器，配21G针头，取血至5 mL，轻轻颠倒数次混匀。离心2 600×g，15 min。取上清，再次离心10 000×g，5 min，上清即PFP。在PFP中加入终浓度为1%的多聚甲醛，室温条件下固定1 h，液氮速冻后-80℃保存备用。

1.3 样本的处理 将多聚甲醛固定的PFP自-80℃冰箱取出，置于37℃水浴中迅速融化后放于冰上。取70 μL PFP，加入10 μL小鼠血清和20 μL 10%BSA，室温条件下封闭30 min。取4支EP管，分为FITC及PE同型对照管、PMVs及EMVs测定管。每管中各加入封闭后的PFP 10 μL。PMVs和EMVs测定管中分别加入FITC标记的血小板表面标志物CD61单抗和PE标记的内皮细胞表面标志物CD144单抗5 μL；FITC及PE同型对照管中分别加入PE标记的小鼠IgG1和FITC标记的小鼠IgG15 μL，室温条件下避光孵育30 min。每管加入300 μL PBS，涡旋混匀后，取300 μL至流式上样管中，加入5×104个2 μm的标准微球，涡旋后上机检测。

1.4 流式细胞仪检测MVs 采用FACS Calibur流式细胞仪检测，将前向角散射信号（forward scatter,FSC）及侧向角散射信号（side scatter,SSC）均置于Log通道。取未经标记的PFP加入1及2 μm混合标准微球，涡旋后上样，建立FSC-SSC对数散点图，调节光电倍增管（photomultiplier tube,PMT）电压。根据FSC设门R1，MVs粒径小于1 μm。取荧光标记后的样本上机分析，将R1内收集到的粒子进一步在FL1或FL2通道进行FITC或PE荧光强度的分析。PMVs定义为粒径小于1 μm且CD61+；EMVs定义为粒径小于1 μm且CD144+。循环血PMVs或EMVs的浓度=（R1内粒子数/流式图中2 μm标准微球数）×上样管内2 μm标准微球浓度×阳性率×稀释倍数。

1.5 IPC处理大鼠循环血中PMVs和EMVs的测定 大鼠（n=5）麻醉后开胸，冠状动脉左前降支（LAD）下穿线，稳定15 min。结扎LAD造成供应区域的心肌缺血，放松LAD使心肌恢复血流灌注。心脏LAD经历5 min缺血，继之5 min再灌注，重复3次，建立IPC模型。经腹主动脉取血后，按前述方法进行PMVs和EMVs测定。

2 结果

2.1 对血液进行抗凝处理的效果 采用较低浓度枸橼酸钠的抗凝效果不佳。3.2%枸橼酸钠与血液按体积比1∶9抗凝，大鼠血液常呈现出部分凝血状态，表现为离心后上层呈胶冻状。改用3.5%枸橼酸钠与血液按体积比1∶4抗凝，离心后可得均匀、清亮的上清，抗凝效果良好。

2.2 PFP制备的效果 依次经历室温条件下2 600×g离心10 min和10 000×g离心5 min得到的PFP中，1 μm以下粒子信号占全部信号的99%以上，循环血中的细胞成分已被去除，见图1。

2.3 对MVs设门的结果 超纯水代替样品上机检测，仪器噪声主要集中在FSC 102以下，见图2 A。使用PFP上样时，可见在FSC 1 μm以下、102以上有较集中的信号群，即MVs，见图2 B、C。

2.4 PMVs及EMVs的鉴定结果 （1）PMVs鉴定结果。FITC同型对照管PFP中加入FITC标记的小鼠IgG1进行孵育后，粒子呈FITC荧光阴性，见图3A。PMVs测定管PFP中加入FITC标记的CD61单抗进行孵育后，可得FITC荧光阳性粒子群，见图3 B、C。（2）EMVs鉴定结果。与PE同型对照相比，EMVs测定管PFP中加入PE标记的CD144单抗进行孵育后，粒子的PE荧光强度发生明显偏移，见图4。

2.5 IPC处理大鼠循环血中PMVs及EMVs的检测结果 IPC处理大鼠循环血中PMVs、EMVs水平分别为（4 053±1 987）个/μL、（4 870±825）个/μL。

3 讨论

健康人体内有少量的MVs。在多种疾病状态下，MVs的数量和表型发生明显改变，而这种变化对疾病的发生、发展和转归均产生影响。MVs的检测方法主要有流式细胞术检测法、显微镜检测法、酶联免疫吸附法及色谱法等。其中，流式细胞术由于具有分析速度快、可同时对检测对象进行定性及定量分析等特性，已成为MVs检测最常用的方法。

大鼠在心血管药理学，特别是在心肌缺血/再灌注损伤(IRI)及其机制的研究中应用十分广泛，其心血管系统反应稳定、灵敏[5-6]。对人血液中MVs的流式细胞术检测方法报道较多[2,7-8]，由于人和大鼠血液成分存在差异，用于人血液中MVs检测的流式细胞计数方法不适于对大鼠标本的检测，影响与MVs相关基础研究的开展。本文选用大鼠为实验动物，建立循环血中MVs的检测方法，为后期研究MVs在大鼠IRI及IPC中的作用和机制打下基础。在分析前血样的准备过程中，影响较大的因素为取血针头的直径、取血后的抗凝处理、离心条件的选择以及样本的储存条件等。取血条件会影响MVs检测，若针头过细（22 G以上），则过高的流体剪切力会导致血小板激活，且易发生溶血；而针头过粗，则不便于对大鼠进行腹主动脉的穿刺。因此，本研究选用21 G的针头进行取血。

凝血过程中血小板会被激活，导致PMVs形成并释放。因此，必须对血液进行抗凝处理。最常用的抗凝剂为枸橼酸钠[9]，也有研究使用EDTA或肝素[10]。Lacroix等[7]的研究显示，与肝素和EDTA相比，枸橼酸钠抗凝极大地减少了MVs在体外的持续释放，且用枸橼酸钠抗凝的血液在室温条件下显示出更好的稳定性。检测人血中MVs时通常采用3.2%枸橼酸钠，抗凝剂与血液的比例是1∶9。笔者采用此种抗凝方案时，大鼠血液常出现部分凝血现象，表现为离心后血浆中出现胶冻状物。鼠类血液中血小板的含量是人类的4～5倍[9]，其血液的凝血活性较强，需要加大抗凝剂的用量。本研究显示，采用3.5%的枸橼酸钠与血液按体积比1∶4混匀，离心后上清均匀、清亮，抗凝效果良好。

离心条件对血液中MVs的分析至关重要[10]。笔者先采用2 600×g，离心10 min以去除血液中绝大多数的细胞成分，再采用10 000×g，离心5 min以去除残余血小板及1 μm以上的细胞碎片。对PFP的流式分析结果显示，99%以上的信号集中在1 μm以下，说明经过两步离心后，血液中的细胞成分基本去除完全。

标本的储存条件也会对MVs的分析产生影响。低温会导致血小板形态的改变，增加取血后MVs在体外的继续释放[8]。血样经一步离心得到的贫血小板血浆，冻融后，其PMVs含量是新鲜样本的10倍[11]。若冻存是不可避免的，则应该先对血样进行两步离心，得到PFP，再进行冻存。文献报道，-80℃保存1年的PFP，其中MVs的数量无变化[7-8]。因此，本实验在取血后立即离心，且前两步离心均在室温下进行，以避免低温造成的血小板激活，最后将PFP液氮速冻后-80℃保存，以最大程度地减少MVs数量在体外的改变。

在使用流式细胞仪对MVs进行分析的过程中，仪器的调节、标准微球的应用以及特异性表面标志物的选择等对于MVs的成功检测非常关键。由于MVs的体积小，接近流式细胞仪的检测下限，极易受杂质和仪器噪声的干扰。因此，本研究采用1μm的标准微球做粒径对照，设置FSC电压，将纯水产生的信号扣除，以减少背景噪音的干扰。同时，利用荧光素标记的特异性表面标志物抗体对样本进行标记，以将特定来源的MVs从样本中识别出来。本研究采用单一特异性表面标志物标记法[12-13]，是因为并非所有MVs表面均带有磷脂酰丝氨酸，即不是所有MVs都呈Annexin V阳性，尤其是EMVs[9]，采用Annexin V进行标记，存在假阴性。并且，由于MVs体积很小，若像细胞一样同时标记多种抗体，可能由于一种抗体产生的膜表面占位效应影响其他抗体的检测结果。血小板特异性表面标志物有CD31、CD41、CD42和CD61，PMVs被定义为CD61+[12]或CD31+/CD42+。内皮细胞特异性表面标志物有CD144、CD105和CD54，EMVs被定义为CD144+， CD31+/CD42b-或CD54+，其中，CD144的特异性最强，是公认的内皮细胞表面标志物。因此，本研究选用单抗体标记，分别采用CD61和CD144对PMVs及EMVs进行鉴定。流式结果显示，加入FITC标记的CD61单抗或PE标记的CD144单抗后，均可得到荧光阳性粒子，表明所选择的抗体能成功的将所需的表型鉴定出来。

随着研究的不断深入，对MVs的关注已扩展到疾病相关的治疗与保护措施方面[12]。MVs作为细胞间传递的新途径，承载着多种多样的生物学功能，其在缺血性心脏病的相关研究中已经引起广泛关注[13-14]。而IPC作为迄今为止发现的最强大的内源性心肌保护机制，已被广泛认可，但其确切机制尚未完全阐明。本研究为今后从MVs角度探讨IPC机制打下了基础。

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（2013-10-25 收稿 2013-12-30修回）

（本文编辑 李国琪）

Detection of Platelets and Endothelial Cell-Derived Microvesicles in Rat Peripheral Blood

ZHANG Mengxiao,SHANG Man,ZHANG Qi,WANG Yao,WU Yanna,SONG Junqiu,LIU Yanxia
Department of Pharmacology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

ObjectiveTo establish a flow-cytometric method to detect microvesicles(MVs)in rat peripheral blood, and to detect platelets-derived MVs(PMVs)and endothelial cell-derived MVs(EMVs)in blood from ischemic preconditioning(IPC)treated rats.MethodsBlood was withdrawn from rat abdominal aorta and anticoagulated with sodium citrate. Platelets-free plasma(PFP)was isolated through two centrifugations at room temperature.PFP was incubated with FITC-conjugated mouse anti-rat CD61 or PE-conjugated mouse anti-rat CD144.Standard beads in diameter of 1 and 2 μm were used for calibration and absolute counting,respectively.Analysis was performed on flow cytometer.ResultsWhen 3.5%sodium citrate was mixed with blood at volume ratio of 1∶4,clear supernatant was collected after centrifugation.Signals of particles smaller than 1 μm accounted for more than 99%of overall signals.PMVs and EMVs were CD61 positive and CD144 positive,respectively.Their diameters were both smaller than 1 μm.The concentration of PMVs and EMVs in peripheral blood from IPC treated rats was(4 053±1 987)/μL and(4 870±825)/μL,respectively.ConclusionThe method for MVs detection by flow cytometry was successfully established and optimized,and verified through detecting PMVs and EMVs in peripheral blood from IPC treated rats.

blood platelets;endothelial cells;flow cytometry;rats,Wistar;microvesicels;ischemic preconditioning

Q24

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.011

*天津市自然科学基金项目（项目编号：11JCZDJC18300）；高校博士学科点专项科研基金项目（项目编号：20101202110005)；天津市高等学校科技发展基金计划项目（项目编号：20110106）

天津医科大学药理教研室（邮编300070）

△通讯作者 E-mail:liu_yanxia126@126.com