改良猪脑死亡模型的建立*

万晨光 冯学泉 李 牧△ 杜洪印 张玮晔 史 源 刘 蕾 沈中阳

实验研究

改良猪脑死亡模型的建立*

万晨光1冯学泉1李 牧1△杜洪印2张玮晔3史 源3刘 蕾3沈中阳3

目的 建立一种稳定、可靠的猪脑死亡模型，为研究脑死亡模型建立过程中、脑死亡判定后的脑组织病理改变及器官移植免疫等变化提供一个更加稳定的动物模型。方法以经典的硬膜外颅内加压法为基础，在长白猪颅内置入Codman有创颅内压监测探头，在实时监测颅内压变化情况下，根据颅内压与平均动脉压（MAP）的关系进行间断颅内加压建立脑死亡模型。结果12例实验用长白猪，1头死于麻醉意外，余11头均成功诱导脑死亡模型。经有效呼吸循环支持可维持脑死亡模型（31.3±4.7）h。通过经颅多普勒、脑电图、心电、MAP等监测显示，脑死亡模型制作过程中各参数变化平稳，脑死亡判定后，动物模型可长时间维持。结论在颅内压监测条件下建立猪脑死亡动脉模型的方法稳定可靠，易于标准化，可为脑死亡模型建立过程中及脑死亡判定后的脑功能及器官移植免疫等研究提供更加稳定的载体。

脑死亡；颅内压；模型，动物；猪；硬膜外颅内加压

脑死亡（brain death，BD）是由哈佛大学医学院于1968年提出的现代死亡概念,指全脑功能不可逆性的丧失。脑死亡概念提出后，脑死亡患者成为器官移植的主要供体来源，但患者外周器官多有缺血、炎症反应[1]，使器官移植术后的治疗更加复杂。本研究以经典的“硬膜外颅内加压法”[2]猪脑死亡模型为基础，应用有创脑组织实时颅内压（intracranial pressure,ICP）监测手段，根据ICP与平均动脉压（MAP）关系进行缓慢间断水囊加压，建立了一种改良的脑死亡动物模型，为研究脑死亡模型建立过程中、脑死亡判定后的脑组织病理改变及器官移植免疫变化等研究提供一个更加稳定的载体。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康、清洁级长白猪12头，体质量（33.6±4.7）kg，雌雄不限，购自天津市实验动物饲养中心，术前禁食12 h，禁水6 h。Codman颅内压监护仪1台，Codman脑组织型ICP监测探头1个，RIMED公司经颅多普勒（transcranial doppler,TCD）仪器1台、美国BIOPAC公司MP150 16通道生理信号记录分析系统1套、harvard动物手术台1个、Matrx model3000麻醉机及Beneview T8麻醉监护仪各1台。

1.2 方法 （1）麻醉。臀部注射10 mg地西泮镇静，肌内注射阿托品1 mL（0.02～0.05 mg/kg）抑制呼吸道分泌物，10 min后给予基础麻醉：肌内注射氯胺酮300 mg（10～30 mg/kg）。仰卧位固定猪，尾部脱毛放置氧饱和度探头。气管插管后，予以维库溴铵维持全身麻醉，膀胱造瘘置入尿管并固定，外接尿袋。（2）动、静脉置管。颈部手术暴露颈外动脉、颈内静脉，直视下单侧颈外动脉切开，向近心端插入导管并固定，外接三通，连接监护仪监测心电图（ECG）、血压（BP）；双侧颈内静脉球部插管，肝素封管以备行血气分析，股静脉插管以液体支持。（3）放置Foley水囊及颅内压监测探头。气管及血管插管后改变实验猪体位，使其俯卧位，顶部去毛，切开头皮，双眼连线与正中矢状线交点后1 cm处行颅骨钻孔术，暴露硬脑膜，钝性分离骨窗周围硬脑膜与颅骨，置入14号Foley水囊导管后用骨蜡封闭钻孔处，缝合头皮。钻孔处后1 cm，右侧旁开2 cm处电钻锥颅，置入Codman脑组织型ICP监测探头并固定，探头距头皮2.5 cm，外接ICP监护仪。（4）置入针状电极。电钻锥颅，第一对电极针（FP1、FP2）置于基线（双眼眶内侧连线）前2 cm，矢状线左右各1 cm；另一对电极针（F7、F8）置于基线后1 cm，矢状线左右各3 cm；第三、四对电极针置于基线后2.5、4 cm，矢状线左右4 cm，连接MP150 16通道生理信号记录分析系统行脑电图（EEG）监测。（5）颅内加压。脑死亡诱导前观察猪ICP、MAP、心率（HR），稳定10 min后，缓慢间断以0.5 mL/min速度向颅内气囊导管内注射生理盐水加压，当ICP＞MAP时停止加压，待MAP上升大于ICP时继续加压，直至MAP不随ICP上升为止。

1.3 脑死亡判定时间及标准 颅内加压停止1 h后停止麻醉支持，继续予以呼吸机辅助呼吸，待麻醉停止1 h后对实验猪进行脑死亡判定。参考我国于2009年颁布的《脑死亡判定标准（成人）》[3]，拟定脑死亡判定标准如下：（1）瞳孔对光反射消失。（2）角膜反射消失。（3）刺激猪头面部，实验猪无反应。（4）无自主呼吸。（5）TCD显示前循环、后循环显示振荡波、尖小收缩波或血流信号消失。（6）脑电图显示电静息。（7）阿托品试验阴性。首次判定12 h后再次复查，结果仍符合脑死亡判定标准者，方可最终确认为脑死亡。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示。

2 结果

2.1 模型成功率及维持时间 12头实验长白猪中1头死于麻醉意外，余11头均成功诱导脑死亡模型，经有效呼吸循环支持可维持脑死亡模型（31.3±4.7）h。

2.2 ICP及MAP情况 在颅内加压前，ICP为（16.2±3.8）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），MAP为（82.3±11.3）mmHg。颅内加压初期，ICP上升缓慢，MAP波动不明显，随着继续加压，ICP剧烈升高，MAP随之急剧升高，停止加压后ICP可达（109.4±9.8）mmHg，MAP可升至（107.4±5.9）mmHg。ICP和MAP在较高水平相持一段时间后，MAP先于ICP开始缓慢下降，后MAP稳定于（62.3±12.1）mmHg，ICP稳定于（51.2±9.7）mmHg。

2.3 心率、心电变化 颅内加压前心率波动于（103.3±12.1）次/min，律齐，各波形正常。颅内加压初期，心率稍有下降，后随ICP增高而增快，高达（204.4±31.2）次/min，S-T段压低。诊断为脑死亡后心率波动于（127.2±14.4）次/min，各波均存在，S-T段压低，未见明显心律失常；在实验猪自然死亡前频繁出现二联律、三联律，后出现室颤波形，血压不能维持，短时间内实验猪心跳停止。

2.4 TCD的变化 在行颅内加压前通过颞窗行TCD检查，大脑中动脉流速（VMCA）为（64.5±5.8）mm/s，开始颅内加压后，VMCA逐渐下降，当收缩压＞ICP＞舒张压时，TCD显示大脑中动脉（MCA）频谱出现舒张期逆向血流。MAP及ICP开始下降后，短时间内MCA频谱变为振荡波、尖小收缩波。

2.5 脑电图的变化 颅内加压初期，EEG显示广泛的爆发，即抑制波形，随着ICP升高，脑电活动减弱，潜伏期延长，波幅降低，MAP及ICP开始下降后脑电图快速变为静息电位，无自主和（或）诱发脑电活动。

3 讨论

3.1 实验动物的选择 目前已有研究描述了用鼠[4]、猫[5]、狗[6]等动物脑死亡模型的建立，本研究以体质量35 kg左右的长白猪为实验动物，对实验设备、实验环境及动物麻醉要求较高，且有以下优点。首先，猪在解剖学、生理学、血液学及疾病发生机制等方面与人极其相似，目前已作为人类疾病动物模型广泛应用于各项生物医学研究。其次，可行颈动脉或颈内静脉置管，行有创动脉压、中心静脉压监测；可行颅骨钻孔硬膜外置入加压水囊，并同时行锥颅置入颅内压监测探头、脑电监测探针等；可方便行经颅多普勒监测脑血流，更好地模拟临床情况，这些都是小动物实验所不能比拟的。

3.2 实验方法的选择 脑死亡模型制作包括颈内动脉结扎法、呼吸暂停法[7]、硬膜外加压法[8]、颅内制造血肿法[9]、断头法等。目前应用较多的为经典的硬膜外水囊加压法，其方法为颅骨中线处钻孔，于硬膜外置入Foley水囊，向水囊注水加压，通过升高颅内压使脑组织缺血缺氧从而进行脑死亡模型的诱导。模型制作的关键在于向水囊加压注水的速度及总量，但报道的速度为0.05～3 mL/min不等[8,10]，总量8～50 mL，差异较大。由于在加压过程中缺乏ICP监测，且ICP的变化与颅腔容积之间呈指数关系，故单以注水速度为指标进行加压较盲目，以致建立起的脑死亡模型个体差异大、稳定性差，不能准确地评价脑死亡后机体生理生化的变化。本研究对经典的硬膜外水囊加压法进行了改良，其核心即在实时ICP监测的条件下缓慢增高颅内压力，使其达到MAP水平，使脑灌注压（cerebral perfusion pressure，CPP=ICP-MAP）为零，进而致全脑缺血、缺氧，引起全脑功能不可逆性丧失，诱导脑死亡模型。

3.3 动物模型的生命体征变化及维持时间 本研究表明，在行加压初期，ICP升高缓慢，随着继续加压，ICP急剧升高，符合体积—压力曲线变化；初期，MAP变化并不明显，后随ICP增高而急剧升高，推测是由于CPP不足以维持颅内血供，机体对ICP增高引起脑组织缺血代偿反应，MAP反射性增高。ICP与MAP在较高水平维持短时间后，MAP先于ICP开始下降，此时脑血流量自动调节功能已丧失，实验猪已濒临脑死亡。在实时ICP监测的条件下进行脑死亡模型的诱导，此方法简便、易行，由于可通过ICP、MAP调整注水加压的速度，模型制作过程稳定，一方面可防止ICP升高过快或过高对脑组织造成不必要的损伤，另一方面也可防止ICP过度波动造成动物循环、心脏功能的大幅波动。

本研究表明，在实时监测ICP的条件下，缓慢间断硬膜外水囊加压方法建立猪脑死亡模型的过程稳定，模型成功率高、易于标准化，可为脑死亡过程中脑功能、器官移植免疫等方面的研究提供了一个更加符合生理的动物模型。

[1]Auråen H,Mollnes TE,Bjørtuft Ø,et al.Multiorgan procurement increases systemic inflammation in brain dead donors[J].Clin Transplant,2013,27(4):613-618.

[2]Pratschke J,Wilhelm MJ,Kusaka M,et al.A model of gradual onset brain death for transplant-associated studies in rats[J].Transplantation,2000,69(3):427-430.

[3]凌锋.脑死亡判定标准(成人)(修订稿)[J].中国脑血管病杂志, 2009,4(5):220-224.

[4] Floerchinger B,Yuan X,Jurisch A,et al.Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model[J].Transpl Immunol,2012,27(1):25-29.

[5]Bruinsma GJ,Nederhoff MG,Geertman HJ,et al.Acute increase of myocardial workload,hemodynamic instability,and myocardial histological changes induced by brain death in the cat[J].Surg Res, 1997,68(1):7-15.

[6]Sereinigg M,Stiegler P,Puntschart A,et al.Establishing a brain-death donor model in pigs[J].Transplant Proc,2012,44(7):2185-2189.

[7] 陈曼娥,李廷琼,陈树生,等.实验性脑死亡动物模型制作法探讨[J].中国神经精神疾病杂志,1983,5(8):295-297.

[8] 朱长举,张弓,翟文龙,等.缓慢间断颅内加压法猪脑死亡模型的建立[J].医药论坛杂志,2008,1(28):26-27，29.

[9]Hvas CL,Fenger-Eriksen C,Høyer S,et al.Hypercoagulation following brain death cannot be reversed by the neutralization of systemic tissue factor[J].Thromb Res,2013,132(2):300-306.

[10]Hvas CL,Nielsen TK,Barklin A,et al.Brain death induced by cerebral haemorrhage-a new porcine model evaluated by CT angiography[J].Acta Anaesthesiol Scand,2012,56(8):995-1005.

（2013-11-19收稿 2013-12-02修回）

（本文编辑 李鹏）

读者·作者·编者

《天津医药》协作办刊单位（排名不分先后）

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天津市口腔医院

天津市第四中心医院

天津医科大学口腔医院

Establishment of Modified Brain Death Model in Pig

WAN Chenguang1,FENG Xuequan1,LI Mu1,DU Hongying2,ZHANG Weiye3,SHI Yuan3,LIU Lei3,SHEN Zhongyang3
1 Department of Neurosurgery,2 Department of Anesthesia,3 Department of Transphant,First Central Clinical Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo establish a stable and reliable model of brain death in swine,and to provide a more stable model for investigating pathomorphology in brain tissue and for studying transplantation immunology during brain death.MethodsBase on the classic methodology of increasing epidural intracranial pressure,Codman intracranial pressure monitoring probes were implanted in landrace pigs invasively.According to the relationship between ICP and MAP,brain death models were established by increasing intracranial pressure slowly and intermittently,with real-time monitoring of the intracranial pressure.ResultsAmong twelve experimental landrace pigs,one died from anesthetic accident,while the rest eleven were successfully established as brain death models.With effective respiratory and circulatory support,those brain death models can be maintained for(31.3±4.7)h.Brain death model establishement is a stable and reliable process demonstrated by transcranial Doppler,EEG,ECG,mean arterial blood pressure and other monitoring methods.After brain death is confirmed,animal models can be maintained for a long time.ConclusionOur methodology of inducing brain death model under ICP monitoring is stable and easy to be standardized.It can also provide a more stable model for studying brain tissue pathomorphology and transplantation immunology.

brain death；intracranial pressure；models,animal；swine；epidural intracranial pressure

R339.39

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.009

*国家863计划（项目编号：2012AA021001）；卫生部2011年度国家临床重点专科建设资助项目（项目编号：卫办医政函[2011]873）

1天津医科大学一中心临床学院神经外科（邮编300192），2麻醉科，3移植外科

△通讯作者 E-mail：Limu5333@163.com