糖化血红蛋白五种检测方法的评价

田伟,陈榕方,王毅,杨宏伟,方军,贾治国

(1、天津市天津医院检验科,天津300211;2、天津市泰达医院检验科,天津300457)

.实验研究.

糖化血红蛋白五种检测方法的评价

田伟1,陈榕方2,王毅1,杨宏伟1,方军1,贾治国1

(1、天津市天津医院检验科,天津300211;2、天津市泰达医院检验科,天津300457)

目的将糖化血红蛋白测定的电泳法、亲和层析法、酶法和免疫法和HPLC法进行比较及评估,为临床医师及实验室在分析不同方法检测糖化血红蛋白结果时提供参考.方法正常对照组45例,DM患者44例,每一份标本在同样条件下用五种方法检测HbA1c,记录测定结果,用于对比分析;选择具有医学决定水平的正常和异常浓度的样本,分别采用5个样本,批内在同一天内重复20次;批间分别在7 d内进行10次测试.计算出批内和批间的均值、标准差和CV值;收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血,同时收集当天健康者的抗凝血.在各种干扰物不同浓度的影响下,如果HbA1c的值上下浮动0.3%,则将视为受到干扰.采用SPSS16.0统计软件包对所测结果进行配对t检验(以HPLC组的实验数据为参照组),检验水准α=0.05.结果5种方法中除外硼酸亲和法,其他四种方法均符合要求;5种方法在4.0%~14.2%范围内线性良好,实测值与理论值的相关系数(r)在0.971~0.996之间,其中HPLC法最好;当加入各种干扰因素时,结果显示HPLC法、酶法、胶乳凝集法测得的HbA1c值上下浮动<0.1%,可见性能稳定、不易受到各种干扰物的影响;电泳受溶血影响非常大;硼酸亲和法对溶血标本显示浓度太低时测不出数,脂血标本显示浓度太高时测不出数;通过标本量、测定时间、CV、r等指标进行比较,HPLC法各种指标远优于其他方法.结论高校液相色谱法(HPLC)作为金标准,批内和批间精密度在所采用的5种方法中是最好的,其次为酶法和胶乳凝集法,而硼酸亲和法的重复性则相对较差.电泳法结果与实验人员扫描和对电泳的波峰判断有关,主观随意性较大,现将HPLC法和电泳法、亲和层析法、酶法和免疫法进行比较,旨在为临床医师及检验科实验室在分析不同方法检测糖化血红蛋白结果时提供参考.

糖化血红蛋白;糖尿病;检测方法;评价

1 材料与方法

1.1 实验对象实验标本主要来自天津市泰达医院体检中心、内分泌科和内科门诊及住院病房的被检者.正常对照组45例,其中男23例,女22例,年龄24~57岁,为本院体检无糖尿病(diabetic mellitus,DM)的健康者;DM患者44例,其中男23例,女21例,年龄45~65岁.以上标本均为空腹静脉采血2ml,EDTAK2抗凝.

1.2 仪器采用美国伯乐公司D-10型全自动糖化血红蛋白分析仪(HPLC法)、法国Sebia公司的HYDRASYS型全自动蛋白电泳仪(电泳法)、挪威产NycoCard Reader II多功能全定量特种蛋白仪(硼酸亲和法)、日立7600型全自动生化仪(酶法和胶乳凝集法)分别测定糖化血红蛋白.

1.3 试剂D-10型分析仪洗脱缓冲液1、2、3和溶血素/清洗液均由美国伯乐公司提供;电泳法的琼脂糖胶板、染液、加样梳、溶血素等均由法国Sebia公司提供;硼酸亲和法的试剂盒由上海奥普生物医药有限公司提供;酶法采用的试剂盒由日本的积水医疗株式会社提供;胶乳凝集法的胶乳、抗体、缓冲液和溶血剂由北京强申医学科技有限公司提供.并且,各方法试剂均用其公司相应批号的标准液和质控液进行定标和质控监测.

1.4 HbA1c检测各种检测方法的操作均按各自试剂盒说明书进行.每一份标本在同样条件下用五种方法检测,记录测定结果,用于对比分析.

1.5 精密度分析选择具有医学决定水平的正常和异常浓度的样本,分别采用5个样本,批内在同一天内重复20次;批间分别在7d内进行10次测试.计算出批内和批间的均值、标准差和CV值[1].

1.6 线性稀释分析收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血,同时收集当天健康者的抗凝血.用0.9%生理盐水稀释成5个浓度梯度的样本,从低浓度到高浓度做直线回归分析,观察其线性范围[2].

1.7 干扰试验分别在血标本中添加56mmo/L葡萄糖、25mmo/L三酰甘油、3.4mmol/L胆红素,以及,均分别取初始浓度标本的1/5、2/5、3/5、4/5、5/5加入样品进行测试.用低温冻融方法制备轻度(Hb< 1g/L)、中度(Hb1~4g/L)以及严重溶血标本(Hb>5g/L)分别进行测试.在各种干扰物不同浓度的影响下,如果HbA1c的值上下浮动0.3%,则将视为受到干扰[2].

1.8 统计学处理采用SPSS16.0统计软件包对所测结果进行配对t检验(以HPLC组的实验数据为参照组),检验水准α=0.05.

2 结果

2.1 精密度按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)文件要求的批内、批间CV应小于5%[3],5种方法中除外硼酸亲和法,其他4种方法均符合要求;相对而言,D-10仪的精密度更佳.见表1.

表1 5种方法测定HbAlc的批内及批间精密度结果

2.2 线性范围将HbA1c值为10.0的全血用HbA1c值为5.2的血进行梯度稀释,结果及线性图如下.见表2.

表2 5种方法线性HbAlc试验结果

2.3 干扰实验当加入各种干扰因素时,结果显示HPLC法、酶法、胶乳凝集法测得的HbA1c值上下浮动<0.1%,可见性能稳定、不易受到各种干扰物的影响;电泳受溶血影响非常大;硼酸亲和法对溶血标本显示浓度太低时测不出数,脂血标本显示浓度太高测不出数.

2.4 对比试验用SPSS16.0统计软件处理所有测定数据,得出以高效液相色谱法为自变量(x)、其它4种方法为因变量(Y)的回归方程及相关系数r.另外,通过标本量、测定时间、CV、r等指标进行比较, D-10型各种指标远优于其他方法,见表3.

表3 5种方法测HbA1c主要参数比较

3 讨论

糖化血红蛋白(HbA1c)作为糖尿病筛选、诊断、血糖控制范围、疗效考核的有效检测指标,在临床中得到广泛的应用.检测HbA1c的方法很多,有高效液相色谱法、电泳法、亲和层析法、酶法和免疫法等.由于高效液相色谱(HPLC)法测定HbA1c使其准确性和重复性得到很大的提高,被公认为监测糖尿病血糖控制的金标准[4].

3.1 精密度由表1可见,高效液相色谱法(HPLC)作为金标准,批内和批间精密度在所采用的5种方法中是最好的,因此法不需对标本进行预处理,全自动检测,人为干扰因素小;其次为酶法和胶乳凝集法,而硼酸亲和法的重复性则相对较差,因其要求手工操作熟练准确、加样精确、层析均匀,故而操作对结果的准确性有一定影响.电泳法结果与实验人员扫描和对电泳的波峰判断有关,主观随意性较大,要求实验人员技术娴熟、经验丰富,否则结果差异较大.

3.2 线性试验观察表2显示的数据及相应的折线图,可知HPLC法与理论值的相关性最好,且线性范围最宽;硼酸亲合法的线性图稍成S形,且浓度越高,偏差越大,可能与其测定结果为总的糖化血红蛋白(所有糖化的血红蛋白)有关.

3.3 干扰实验56mmol/L葡萄糖、25mmol/L三酰甘油和3.4mmol/L胆红素对HPLC法、酶法和胶乳凝集法均无干扰,可见性能稳定、抗干扰能力较强;但是脂血和溶血标本对电泳法和硼酸亲和法影响很大-电泳受溶血影响非常大,严重溶血后比溶血前测得的值要明显偏低;硼酸亲和法对溶血标本显示浓度太低、脂血标本显示浓度太高,均无法测定.

3.4 对比试验与参考范围表3的结果表明,5种方法同时检测同一标本时,酶法与HPLC法的结果最接近.另外,以HPLC法为参比(X),其他4种方法分别为因变量(Y)得出回归方程并进行配对t检验,得出各个txy均大于tα,P<0.05,说明各组差异均有统计学意义.5种方法的参考范围分别为4.5% ~6.3%、3.6%~5.6%、4.5%~6.3%、4.3%~5.8%和3.8%~5.8%.

美国伯乐公司的全自动糖化血红蛋白分析仪是采用离子交换高效液相色谱分析,可对血液总血红蛋白中的HbA1c(%)进行分析,利用3种不同浓度洗脱液进行梯度分离,将其与其他组分(FP、HbA1a、HbA1b、HbF、HbAO)区分开,同时还测定出HbA1、HbF的值,并且比较方便于插入急诊,CV值小于1%,性能稳定不易受到各种共存干扰物的影响,全程自动化工作无人为因素的影响,具有精密度高、测试速度快、操作简便等特点,为医生调整糖尿病治疗方案提供确实可靠的依据.此方法曾应用于美国糖尿病控制与并发症研究,是目前检测HbA1c的金标准.D-10检测HbA1c能快速准确地为医生提供糖尿病患者血糖控制状况的信息,从而能妥当地调整治疗方案,减少因实验室误差所带来的误诊、误治.法国Sebia公司的全自动蛋白电泳仪,在工作中发现测定糖化血红蛋白需成批进行样本分析,速度比较慢,无法进行实时检测,自动化程度较差,所测结果与技术人员扫描和对电泳的峰波判断有关,随意性较大,且无急诊插入和自动维护等功能,但具有可发现异常血红蛋白的功能.硼酸亲和层析法,操作简便易行、试剂稳定,不需贵重仪器,但测定结果为总糖化血红蛋白,与其他方法所测结果比较时应注意.酶法和胶乳凝集法都具有相当好的重复性,成本较低,不需要额外添置仪器,但放入仪器之前均需要做离心和混合溶血素的预处理,相对D-10仪操作不够简便.

[1]周新,涂植光.临床生物化学和生物化学检验[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2006:33.

[2]杨昌国,许叶.线性评价和干扰试验中NCCLS评价方案的应用[J].临床检验杂志,1999,17(3):47-49.

[3]杨昌国,许叶.精密度评价和方法比较中NCCLS评价方案的应用[J].临床检验杂志,1999,17(1):184-198.

[4]宋银丹,段勇.糖化血红蛋白检测标准化的研究进展[J].实验与检验医学,2013,31(2):108-110.

R446.62,R587.1,R446.11+2

A

1674-1129(2014)03-0252-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.007

2013-09-11;

2014-03-28)

田伟,男,1982年出生,本科学历,初级技师,研究方向为临床生物化学检验.