江西汉族人群NRG3基因rs17101655 T→G单核苷酸多态性与ITP的关联性研究

李丽华,徐颜美,李静,黄波,刘静,章海斌,陈鑫,陈希敏,林晋,黄林凤,王小中

(1、深圳市宝安妇幼保健院检验科,广东深圳518133;2、南昌大学第二附属医院检验科,江西南昌330006;3、南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006)

.论著.

江西汉族人群NRG3基因rs17101655 T→G单核苷酸多态性与ITP的关联性研究

李丽华1,2*,徐颜美2*,李静3,黄波2,刘静2,章海斌2,陈鑫2,陈希敏2,林晋2,黄林凤2,王小中2

(1、深圳市宝安妇幼保健院检验科,广东深圳518133;2、南昌大学第二附属医院检验科,江西南昌330006;3、南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006)

目的运用TaqMan探针法对NRG3基因rs17101655 T→G单核苷酸多态性进行基因分型,探讨rs17101655 T→G单核苷酸多态性与原发免疫性血小板减少症(ITP)的关联性,为该病的发病机制提供重要线索.方法针对NRG3基因rs17101655位点T→G多态性,设计1对PCR引物和TaqMan探针,通过实时荧光PCR扩增进行基因分型;采用病例-对照研究,对中国汉族江西地区200例ITP和200例健康对照人群进行基因分型,比较两组人群基因型分布及频率差异.结果Rs17101655位点T→G多态性的基因型和等位基因频率分布在ITP病例组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05).结论TaqMan探针法可快速、高效地对单核苷酸多态性进行基因分型,本研究结果显示NRG3基因rs17101655位点不作为中国汉族人群ITP的易感位点.

原发免疫性血小板减少症;TaqMan探针;单核苷酸多态性

原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性疾病,成人发病率为5~10/10万左右,该病的高发人群为育龄期女性及60岁以上老年人[1].主要临床表现为全身皮肤黏膜或内脏出血,严重者可出现颅内出血[2].近年来,遗传易感性在ITP的发病机制中的作用备受关注.研究者采用候选基因法已发现多种ITP的易感基因[3],但这些基因远远不足以解释ITP发病的遗传机制.最新研究排除饮食、药物等多种血小板计数干扰因素后,发现NRG3基因与血小板计数显著相关[4].考虑到ITP疾病主要由于血小板计数极度减低而出现一系列的临床症状,因此本研究推测影响血小板计数变化的基因可能在ITP的发病机制中也发挥不可忽视的作用.为证实这一想法,本研究采用TaqMan探针技术初步探讨NGR3基因rs17101655 T→G多态性与ITP的关联.

1 材料与方法

1.1 一般资料按《成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识》诊断标准[5]收集确诊的ITP患者200例,以及与病例组年龄,种族,性别相匹配的健康体检者200例,分别收取2ml EDTA抗凝静脉血.病例组样本来自于南昌大学第二附属医院2011年1月至2013年6月期间的住院和门诊ITP患者,均为中国汉族人,无亲属关系及排除遗传病史者.其中男性65例,女性135例,男:女=1: 2.1.所有样本均来自江西地区,个体间无地域差异性.

1.2 仪器与试剂ViiA7实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司),Theromo NanoDrop 2000C紫外/可见分光光度定量仪(中国赛默飞世尔科技有限公司), LX-100手掌型离心机(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司).

血液基因组柱式提取试剂盒(德国Qiagen公司), TaqMan SNP Genotyping Assays(美国Life Technologies),TaqManR Genotyping Master Mix(美国Life Technologies),ddH2O(本实验室自备的无菌水).

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取、检测及稀释采用天根血液基因组柱式提取试剂盒严格按说明书操作提取抗凝静脉血中的全基因组DNA,通过Theromo NanoDrop 2000C紫外/可见分光光度定量仪器进行DNA定量检测,记录DNA纯度和浓度值.以纯度OD260/280位于1.8~2.0为合格样本.并用ddH2O将DNA母液定量稀释至15μl终浓度为20ng/μl工作液,用于后续TaqMan分型检测.

1.3.2 TaqMan探针和引物设计针对rs17101655 T→G位点所设计的两条探针分别用VIC和FAM进行荧光标记,由美国ABI Life technology公司设计并合成,探针及引物贮存液为40倍浓缩液(40X TaqMan SNP Genotyping Assay Mix).ABI公司合成rs17101655 T→G探针试剂编号(Assay ID)为AHD19QU.

1.3.3 rs17101655 T→G分型PCR总反应体系为10μl,包括(2XTaqMan Genotyping Master Mix)5μl、引物与探针混合液(40XTaqMan SNP Genotyping Assay Mix)0.25μl、模板DNA(20ng/μl)1μl、ddH2O 3.25μl.每96孔板设置1个空白对照.反应程序为pre-read stage 60℃,30s;hold stage:95℃,10min;反应条件为95℃,15s,60℃1min,60℃30s,共40个循环;post-read stage 60℃1min.反应在ViiA7实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行,利用TaqMan Genotyper软件自动基因分型.

1.3.4 基因分型结果判定Life technology公司采用VIC和FAM荧光素标记rs17101655位点的G和T等位基因.当样本基因型为纯合子GG时, PCR扩增曲线显示VIC荧光信号值远远高于FAM荧光信号值;当样本基因型为纯合子TT时,PCR扩增曲线显示FAM荧光信号值远远高于VIC荧光信号值;当样本基因型为杂合子TG时,PCR扩增曲线显示FAM荧光信号值约等于VIC荧光信号值.

1.4 统计分析采用基因计数法计算SNP多态位点的等位基因频率和基因型频率,以拟合优度χ2检验分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律.采用比值比(odds ratio,OR)和95%置信区间(95%confidence interval,CI)分析基因多态性与ITP的关联强度.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验病例组和对照组人群rs17101655 T→G位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明本研究人群来自遗传平衡的群体,见表1.

表1 基因型频数分布的Hardy-Weinberg平衡检验

2.2 rs17101655位点等位基因的TaqMan分型结果rs17101655位点具有T和G两种等位基因,共TT、TG和GG 3种基因型.本实验分型结果显示ITP组TT型187例,TG型12例,GG型1例;对照组TT型194例,TG型6例,GG型0例(见图1),该结果与人类基因组计划(HapMap)公布的中国北京人的SNP分型数据相一致.

2.3 rs17101655位点基因型频率和等位基因频率与中国汉族江西地区ITP的关系ITP病例组rs17101655位点TT、TG和GG基因型频率分别为93.5%、6%和0.5%,对照组的基因型频率分别为97.0%、3.0%和0.0%.rs17101655位点与ITP疾病的发生存在一定的风险(OR=2.07,95%CI=0.76~ 5.64),但该位点的基因型频率在两组间比较,差异无统计学意义(χ2=2.13,P=0.34)(见表2).等位基因T在ITP病例组和对照组中的频率分别为96.5%和98.5%,等位基因G在ITP病例组和对照组中的频率分别为3.5%和1.5%.G等位基因为风险等位基因(OR=2.38,95%CI=1.19~4.75).两组人群间等位基因频率差异无统计学意义(χ2=2.51,P=0.11)见表3.

图1 TaqMan技术分型rs17101655位点等位基因的结果

表2 rs17101655位点基因型频率分布及其与ITP的关系

表3 rs17101655位点等位基因频率分布及其与ITP的关系

3 讨论

为深入理解ITP的遗传机制,研究者纷纷采用候选基因法发现63种ITP的易感基因,主要集中于细胞因子、Fc受体、DNA甲基化和HLA等方面[6].但这些基因不足以充分解释ITP的发病机制.研究者对75例健康儿童,排除多种干扰因素后,发现神经调节蛋白3(NRG3)基因与血小板计数显著相关[4],但其具体的作用机制仍然不清.考虑到ITP主要由于血小板计数极度减低而出现一系列的临床症状,因此本研究推测影响血小板计数的基因可能在ITP的发病过程中起重要作用.因此本研究采用病例-对照研究方案,通过TaqMan探针技术对江西地区部分ITP患者进行NRG3基因rs17101655 T→G单核苷酸多态性的关联性研究.

目前,国内外尚无ITP疾病与NRG3基因rs17101655 T→G位点的关联性研究报道,本研究为首次对ITP与NRG3基因的关联性研究.结果显示ITP病例组rs17101655位点TG基因型频率(6.0%)高于对照组(3.0%),但rs17101655位点的基因型频率及等位基因频率在两组间的差异无统计学意义(P>0.05).本研究结果表明rs17101655 T→G位点与ITP的发病无潜在关联.由于样本量小,研究对象和地域局限,其结果代表性不强,因此需要更多的大规模病例对照研究来进一步证实该位点与ITP的关联性.另外,NRG3基因可能在正常生理情况下控制血小板计数,而在ITP这种病理环境下并不起控制血小板计数的主导作用.

此外,本研究进一步证实TaqMan探针法能高效准确地进行单核苷酸多态性分型,具有操作简便、省时、省力等优点.鉴于探针与引物混合液对外界DNA极其敏感,易受空气中气溶胶等的影响,因此在TaqMan探针法实验实际操作过程中应严格在超净工作台内进行,且操作前应对移液枪等器材进行紫外线消毒,以避免外界DNA混入PCR反应体系中,而导致分型错误.

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[4]Guerrero JA,Rivera J,Quiroga T,et al.Novel loci involved in platelet function and platelet count identified by a genome-wide study performed in children[J].Haematologica,2011,96(9):1335-1343.

[5]侯明,秦平.成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识(修订版)[J].中华血液学杂志,2011,32(3):214-216.

[6]徐颜美,邓立彬,王小中.原发免疫性血小板减少性紫癜的遗传学研究进展[J].重庆医学,2014,43(13):2544-2546.

A study of the correlation between NRG3 gene rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism and ITP in Han popu-lation of Jiangxi

LI Lihua,XU Yanmei,LI Jing,et al.Department of Clinical Laboratory,the Maternity and Child Health Care Hospital of Baoan District in Shenzhen,Shenzhen Guangdong 518133,China

ObjectiveTo explore the correlation between NRG3 rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism and primary immune thrombocytopenic purpura(ITP)with the TaqMan probe technology,and provide novel important clues for understanding the pathogenic mechanism of ITP.MethodsA case-control study was applied to detect rs17101655 T→G polymorphism, a total of 200 ITP patients and 200 controls were enrolled from the Han population of Jiangxi region in China.One pair of special TaqMan probe and PCR primers for NRG3 rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism was designed,and the genotyping was conducted by real-time PCR.Then the difference of genotype distribution and allele frequency between the two groups was compared.ResultsThe genotype distribution and allele frequency of rs17101655 T→G polymorphism between cases and controls have not significantly statistical difference(P>0.05).ConclusionsThe TaqMan probe method can rapidly and efficiently genotyping for single nucleotide polymorphisms.Our results showed that NRG3 gene rs17101655 polymorphism cannot be a susceptibility locus for ITP in the Han population of Jiangxi.

Primary immune thrombocytopenic purpura;TaqMan probe;Single nucleotide polymorphism

R558+.2

A

1674-1129(2014)03-0237-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.002

2014-02-20;

2014-02-27)

江西省教育厅课题基金资助项目(No:GJJ13157);江西省研究生创新专项基金资助金项目(No:YC2012-S027).作者简介:李丽华,女,1978年出生,在职研究生,研究方向:血小板疾病及诊断.

徐颜美,女,1989年出生,南昌大学在读研究生,研究方向为血液病遗传学*(共同第一作者).

王小中,男,1973年生,博士生导师.