CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测在急性髓系白血病中的应用

吴琼,李洁,方江春,贺文凤

(1、南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西南昌330006;2、萍乡市人民医院血液科,江西萍乡337055)

CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测在急性髓系白血病中的应用

吴琼1,李洁1,方江春2,贺文凤1

(1、南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西南昌330006;2、萍乡市人民医院血液科,江西萍乡337055)

目的探讨CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测与急性髓系白血病的发病机制、治疗效果及预后的关系,并与CD4+CD25+/CD4+法比较两种检测方法是否存在差异.方法应用流式细胞术法分别检测41例初治AML患者(初治组)、11例一次化疗缓解的患者(化疗敏感组)、9例两次以上化疗不缓解的患者(化疗耐药组)、13例化疗缓解后一直没有复发的患者(持续缓解组)、8例化疗缓解后又再次复发的患者(复发组)和20例健康体检者(对照组)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/ CD4+在外周血中的比例.结果与对照组相比较,AML患者初治组两类细胞比例均较正常人明显升高(P<0.01),初治患者组两种检测方法间存在显著差异(P<0.01).与化疗缓解组比较,化疗耐药组两种检测方法检测的比例均明显升高(P<0.01),耐药患者组两种方法间存在显著差异(P<0.01).与持续缓解组比较,复发组患者的比例明显升高(P<0.01),复发组两种方法间存在显著差异(P<0.01).结论急性髓系白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+与急性髓系白血病的发生相关,并且检测其比例能预测白血病患者对化疗药物的反应及预后,且其灵敏度高于CD4+CD25+/CD4+检测法,而其特异性与CD4+Foxp3+/CD4+检测法一致.

CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞;急性髓系白血病;流式细胞术

急性白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病,目前对于急性白血病的治疗最有效的手段是造血干细胞移植,然而由于供者来源的局限性、手术费用高等因素使得免疫治疗逐渐成为了治疗肿瘤的新手段.调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是一种重要的免疫调节细胞与血液肿瘤的发生有着密切联系,以往研究将CD4+CD25+Treg细胞作为肿瘤免疫机制研究的主要对象,然而由于CD25并不是Treg的独特标志,使得有关CD4+CD25+Treg细胞的研究存在矛盾的结果.本研究通过流式细胞仪检测比较了正常人、急性髓系白血病初治者、缓解者及复发者外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+在外周血中的比例,并与CD4+CD25+/CD4+法进行比较,从而探讨CD4+CD25+Foxp3+与急性白血病的发病机制、治疗效果及预后的关系,探讨两者间更为敏感和特异的检测方法,为急性白血病的发病机制及免疫治疗提供依据.

1 材料与方法

1.1 研究对象选取南昌大学第二附属医院血液科2009年2月-2011年12月所有急性髓系白血病住院患者,总共41例,男性24例,女性17例,平均年龄45岁.所有急性白血病患者均经过临床、骨髓细胞学、染色体、白血病免疫分型确诊.依据FAB分型M3 15例,M2 17例,M4 3例,M16例.将上述初治病人经一次化疗缓解的患者作为化疗敏感组,总共11例;经两次以上化疗不缓解的患者作为化疗耐药组,总共9例;经一次化疗缓解后不再复发的患者作为持续缓解组,总共13例;经化疗缓解后又再次复发的患者作为复发组,总共8例.诊断及疗效均符合邓家栋编著的《临床血液病学诊断标准》之国内诊疗标准.正常对照组来自我院体检中心,其中男性11例,女性9例,平均年龄32岁.

1.2 主要试剂和仪器用于Treg细胞检测的荧光抗体:PE标记的鼠抗人IgG抗体、FITC标记的抗人CD4、APC标记的抗人CD25、PE标记的抗人Foxp3抗体以及10X的破膜剂和溶血素,以上试剂均来自美国BD公司;流式细胞仪为美国BD公司Fascalibur型四色流式细胞仪;移液器为美国eppendorf公司;台式离心机为上海飞鸽牌TDL-5-A型.

1.3 Treg细胞检测采集外周血2ml加入EDTA抗凝管,充分混匀;准备两根流式管,标明同型对照管和检测管,分别以1、2表示;取外周血100ul分别加入两管,1、2管都加入CD4-FITC/CD25-APC各20μl,暗室室温避光孵育20~30min;避光孵育后加入稀释的溶血素和破膜剂,反应后以破膜缓冲液洗涤并重悬,1管加入IgG-PE 5μl,2管加入Foxp3-PE 20μl,暗室室温避光孵育20~ 30min;加入5ml PBS缓冲液洗涤,1200r/min离心5min去上清.加入400μlPBS缓冲液上机检测.用FSC/SSC参数先找到淋巴细胞群,找到CD4+CD25+双阳细胞群,IgG-PE为同型对照,使用对照管调整补偿和电压,使得阴性细胞群位于点图的左下角,收集至少10000个细胞,以CD4+CD25+双阳细胞射门,分析Foxp3的百分率,在计算机上用Cell Quest软件分析数据,减去阴性对照管的非特异性对照值.

1.4 统计学处理所有数据采用SPSS17.0统计软件进行分析,实验数据以均数±标准差(x±s),P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 正常人和急性白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达20例对照组外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+细胞比例为(1.05±0.10)%,CD4+CD25+/CD4+细胞比例为(0.98± 0.07)%,两者间无统计学差异(P>0.05).41例初治组的比例分别为(49.37±2.08)%及(5.56±0.38)%,两者间有统计学差异(P<0.01),初治患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+均高于正常人,具有统计学差异(P<0.01).见表1.

表1 正常人、急性白血病初治患者外周血Foxp3+的表达

2.2 化疗耐药和化疗敏感患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达9例化疗耐药组外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+细胞比例为(47.97±0.91)%,CD4+CD25+/CD4+细胞比例为(6.87± 0.58)%,两种方法具有统计学差异(P<0.01).11例化疗敏感组的比例分别为(0.91±0.07)%及(0.85±0.05)%,两种方法间无统计学差异(P>0.05).化疗耐药组患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+细胞比例及CD4+CD25+/CD4+细胞比例均高于化疗敏感组患者,两组间具有统计学差异(P<0.01).见表2.

表2 化疗耐药组、化疗敏感组患者外周血Foxp3+的表达

2.3 持续缓解患者和复发患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达13例持续缓解组外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+细胞占CD4+CD25+/CD4+细胞比例分别为(1.67±0.06)%和(1.52± 0.12)%,两者间无统计学差异(P>0.05).8例复发组比例分别为(50.50±1.46)%及(6.58±0.59)%,两者间有统计学差异(P<0.01),复发患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+均高于持续缓解者,具有统计学差异(P<0.01).见表3.

表3 持续缓解组、复发组患者外周血Foxp3+的表达

3 讨论

Treg是CD4+T细胞的一种独特的亚型,是一类具有免疫无反应性和免疫抑制性的T细胞亚群,具有主动调控或抑制其他免疫活性细胞的功能,在免疫反应中起到关键性的作用.以往研究认为白介素-2(IL-2)受体α链(CD25)是Treg细胞的特异标志,并将CD4+CD25+作为研究Treg的标志.目前有关CD4+CD25+与肿瘤的关系已经有了大量的研究,在胃癌、乳腺癌、肝癌等多种实体瘤患者的外周血和肿瘤局部,CD4+CD25+Treg的数量都比正常人明显增高[1-3].Beyer等[4]对3例慢性淋巴细胞白血病患者和42例正常人外周血进行分析,发现CTLA4+、Foxp3、GITR、TGF-β1、CD62L+、IL-10在慢性淋巴细胞白血病初治患者中的表达较正常人明显升高.慢性淋巴细胞白血病患者在使用氟达拉滨连续化疗后,外周血中的Tregs相应下调,并且出现了抑制功能的减弱,甚至消失.Beyer等[4-5]对急性髓系白血病患者的CD4+CD25+Treg细胞进行研究,发现患者组CD4+CD25+Treg细胞占外周血CD4+T细胞中的比例较正常对照组明显增高,而且与患者的病程、疾病的预后明显相关,提示肿瘤患者血清中可能存在某种能够促进CD4+CD25+Treg细胞生成的物质,使之具有天然的免疫反应,并具有促进机体免疫抑制的作用.然而,肿瘤抗原特异的免疫治疗效果目前并不令人十分满意,有关CD4+CD25+Treg细胞的研究结果也存在一定的不一致性,研究者们开始考虑这种结果的不一致是否与CD4+CD25+不能特异性的代表Treg细胞有关[6].

Foxp3属于foxhead家族分叉头/翼状螺旋转录调节因子,是细胞获得免疫调节特性的关键转录因子,目前认为Foxp3是Treg细胞的特异标志,其表达正常是CD4+CD25+Treg发挥作用的前提[7]. Rudemky[8]等研究证明Foxp3在调节性T细胞特异性表达,有着调控Tregs的发育及功能的作用. Shenghui Z[9]等利用多色流式细胞术在外周血和骨髓中检测CD127、CD4和CD25来鉴定出Foxp3+Treg,研究发现CD4+CD25+CD127lowTreg频率显著增加,并且在初治的AML病人的外周血中它们的表型是不同于健康志愿者,当AML治疗完全缓解后Treg频率下降了,当AML复发后Treg频率又上升了.在完全缓解的病人诊断时期外周血和骨髓的Treg频率要低于持续不能缓解的病人.目前有关CD4+CD25+Foxp3+与急性白血病发病机制、预后等方面的研究还未见报道.

本研究通过流式细胞检测发现初治患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于正常对照;耐药组患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于化疗敏感组;复发组患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于持续缓解组;初治患者组、耐药组及复发组两种检测方法存在显著差异, CD4+CD25+/CD4+结果与以往报道相似[10],CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测法与对照的差异显著高于CD4+CD25+/CD4+检测法.

通过本研究提示急性白血病患者体内CD4+CD25+Foxp3+细胞增高可能导致了白血病细胞逃避免疫清除,抑制了机体免疫系统对白血病细胞的有效攻击,使白血病细胞产生免疫逃逸,从而导致白血病的发生.CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例增高可能提示患者对化疗药物反应差,患者很难达到缓解,CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量有可能是预测患者对药物疗效的重要指标之一.CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量可能是引起急性白血病的复发的原因之一,并有可能作为一项提示疾病复发的指标.检测CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测法可能比以往报道的检测CD4+CD25+/CD4+的方法更敏感,而特异性一致.因此,CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的检测可能能更好的作为预测患者疗效、监测疾病复发和判断预后的一个指标.

CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞是急性白血病患者免疫抑制并导致肿瘤免疫逃逸的一个重要原因之一,下调Treg细胞数量或功能有可能提高患者抗肿瘤免疫效应,这为以Treg为靶标的免疫调控治疗策略提供有益的启示,为临床最终治愈AML患者提供新的策略.

[1]孙广增.胃癌患者血清NO、IL-2及CD4+CD25+水平变化及临床意义[J].山东医药,2011,51(27):86-87.

[2]王嗣予,福军亮,吕吉云,等.原发性肝癌患者体内调节性T细胞的生成和数量增加与疾病进展相关分析[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(6):668-670.

[3.]Li C H,Kuo W H,Chang W C,et al.Activation of regulatory T cells instigates functional down-regulation of cytotoxic T lympho-cytes in human breast cancer[J].Immunol Res,2011,51(1):71-9.

[4]Beyer M,Kochanek M,Darabi K,et al.Reduced frequencies and sup-pressive function of CD4+CD25+regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine [J].Blood,2005,106(6):2018-2025.

[5]Wang X,Zheng J,Liu J,et al.Incerased population of CD4+CD25+ high regulatory T cells with their higer apoptotic and proliferating status in peripheral blood of acute myeloid Leukemia patients[J]. Eur J Haematol,2005,75(6):468-476.

[6]吕凌.介导CD4+CD25+调节性T细胞发育与功能的一个关键基因-Foxp3[J].国际免疫学杂志,2006,29(2):65-68.

[7]Brunkow ME,Jeffery EW,Hjirrild KA,et al.Disruption of a new fork-head/winged-helix protein,scurfin,results in fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27 (1):68-73.

[8]Fontenot JD,Gavin MA,Rudemky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(4):330-336.

[9]Shenghui Z,Yixiang H,Jianbo W,et al.Elevated frequencies of CD4 CD25 CD127lo regulatory T cells is associated to poor prognosis in patients with acute myeloid leukemia[J].Int J Cancer, 2011,129(6):1373-1381.

[10]陶贞霞,郭晓玲,孟宇,等.CD4+CD25+调节性T细胞检测在急性髓细胞白血病中的临床意义[J].临床血液学杂志,2013,26(7):452-454.

The application of detecting CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+Tregs in acute leukemia

ObjectiveTo explore the significance of CD4+CD25+Foxp3+Tregs detection in the pathogenesis,curative effect and prognosis of acute leukemia,and compare it with the method of CD4+CD25+/CD4+detection and determine whether there is difference between the two methods.MethodsThe proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood were tested in 41 cases of untreated patients with AML(Initial treatment group),11 cases of remission-patients after one period of chemotherapy (Chemotherapy sensitive group),9 cases of non-remission-patients after two period of chemotherapy(Chemotherapy resistance group),13 cases of recurrence-free-patients achieving chemotherapy remission(Sustained remission group),8 relapsed patients achieving Chemotherapy remission(Relapse group),20 cases of healthy donators(control group)by using flow cytometry,and the proportion of CD4+CD25+Foxp+Tregs cells in the peripheral blood with the method of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+were detected.ResultsThe proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of initial treatment group was greatly higher than that of control group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+detection.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of chemotherapy resistance group was greatly higher than that of chemotherapy sensitive group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+detection in the chemotherapy resistance group and chemotherapy sensitive group.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of relapse group was greatly higher than that of sustained remission group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/ CD4+detection in the relapse group and sustained remission group.ConclusionsThe significant increased rate of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in peripheral blood of AML patients may be related to the occurrence of leukemia and the detection of the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs can predict prognosis and response to chemotherapy in patients with leukemia.And its detection sensitivity is higher than that of the CD4+CD25+/CD4+detection method,but its specificity is consistant with the method ofCD4+Foxp3+/CD4+assay.

CD4+CD25+Foxp3+Tregs;Foxp3;Acute leukemia;Flow cytometry

R733.7,R446.62

A

1674-1129(2014)03-0246-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.005

2013-10-31;

2013-11-26)

江西省卫生厅科技计划(编号:20093049)

吴琼,女,1984年出生,主管技师,医学检验,研究方向流式细胞术.

李洁,女,1963出生,实验师,研究方向为流式细胞术.

WU Qiong,LI Jie,FANG Jiangchun,etal.The Key Molecular Medical Laboratory of Jiangxi Province,the Second Affilicated Hospital of Nanchang University,Nanchang330006,China