小檗碱对外科术后产AmpC酶分离菌株的抑菌作用

徐剑,司徒瑞儒,林勇平

(1、广州市海珠区妇幼保健院外科,广东广州510220;2、广州市海珠区第一人民医院检验科,广东广州510220;3、广州医学院第一附属医院检验科,广东广州510120)

小檗碱对外科术后产AmpC酶分离菌株的抑菌作用

徐剑1,司徒瑞儒2,林勇平3

(1、广州市海珠区妇幼保健院外科,广东广州510220;2、广州市海珠区第一人民医院检验科,广东广州510220;3、广州医学院第一附属医院检验科,广东广州510120)

目的了解外科术后感染的病原菌分布情况并探讨小檗碱对产AmpC酶术后感染分离菌株的抗菌作用.方法从术后感染病人中分离出产AmpC酶细菌,并采用琼脂对倍稀释法、肉汤稀释法分别检测小檗碱对产AmpC酶三种分离菌株的最低抑菌作用.结果共分离出G-杆菌225株,其中产AmpC酶大肠埃希菌46株,有27株MIC为浓度31.25g/l小檗碱;高产AmpC酶肺炎克雷伯菌有26株,有13株MIC为浓度31.25g/l小檗碱;产AmpC铜绿假单胞菌21株,有12株MIC为浓度60.25g/l小檗碱.浓度为15.62g/L小檗碱对产AmpC酶分离菌基本上无抑制作用.G+的病原菌有170株,其中金黄色葡萄球菌94例,表皮葡萄球菌36例,真菌27例.结论产AmpC酶的G-杆菌在术后感染中较为常见,而小檗碱对产AmpC酶细菌株有一定的抑菌作用,值得临床上推广应用,以减少滥用抗生素而引起多重耐药的产生.

术后感染;小檗碱;产AmpC酶;抗菌作用

近年来,随着医疗技术的发展和新的抗生素出现,特别是β-内酰胺类抗生素的推广和滥用,术后切口感染率有不断上升的趋势,病原菌的耐药性也日益增高.第三代头孢菌素的广泛应用,产AmpC酶细菌感染也日益严重.这会延长患者的住院时间,增加治疗费用,甚至还可能导至治疗失败.产AmpC酶细菌的感染,已给术后治疗带来了新的挑战.AmpC酶是由G-杆菌产生,由染色体或质粒介导的一类β-内酰胺酶.β-内酰胺酶按分子结构分类法可分为C类和Bush Jacoby Medeiros类,C类作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶.而且还易引起耐药性的漫延[1].在我国,中药资源丰富,价格低廉,如果能从中草药中开发出纯天然抗生素对术后感染病人的治疗有着重要的意义.小檗碱是黄连、黄柏及三黄汤等中药的主要活性成分,是一种常用的属异喹啉类生物碱,其价格低廉,具有广谱抗菌作用[2].而质粒介导的超广谱β-内酰胺酶及染色体突变去阻遏持续高产AmpC酶是导致细菌对第三代头孢菌素耐药的两类最重要的酶.如果能从中草药中找出抑制这二种酶的中草药,充分利用我国的中草药资源,生产出新型抗菌药物,为临床上治疗产AmpC酶细菌所引起的感染提供新的手段.对我国医疗事业的发展具有重要的意义.本文通过分析手术切口感染菌的分布情况,并用小檗碱对产AmpC酶分离菌株进行抑菌作用试验,探讨小檗碱对产AmpC酶菌株的抑菌作用.

1 材料与方法

1.1 材料所有的检测菌株均来自我院和广州医学院第一附属医院2010年1月至2012年12月的外科术后伤口感染非重复分离菌株,其中G-杆菌225株,G+球菌170株,用常规方法分离培养,鉴定,并通过AmpC酶检测确定产AmpC酶大肠埃希菌46株,高产AmpC酶肺炎克雷伯菌26株,产AmpC酶铜绿假单胞菌21株.

1.2 方法严格按照CLSI推荐方法对切口感染病原菌分离培养,并用珠海迪尔的微生物鉴定仪对分离菌鉴定.

1.3 AmpC酶检测大肠埃希菌和铜绿假单胞菌AmpC酶检测采用FOX纸片的耐药性测定,均严格按照CLSI推荐的方法进行.持续高产AmpC酶细菌检测采用三维酶粗提法检测.

1.4 MIC测定方法用琼脂稀释法配制出含小檗碱浓度为500g/L、250g/L、125g/L、62.5g/L、31.25g/L和15.6g/L的MH平板,并另用不含中药的MH平板作为对照.将分纯后的目标菌株35℃培养18h后,配制成浓度约为1.5X107个/ml菌夜,再用定量环接种在含不同浓度小檗碱的平板上,检测最小抑菌浓度.

1.5 仪器和材料实验仪器主为珠海迪尔DL-96微生物检测仪,药敏纸片购自英国Oxoid公司,鉴定试剂由珠海迪尔公司提供,MH、血培养基购自江门凯林公司,小檗碱由中国药品生物制品检定所提供.

2 结果

2.1 伤口感染菌群分情况共检查出G-病原菌225例,其中大肠埃希菌93例,肺炎克雷伯菌68例,铜绿假单胞菌43例,产AmpC酶的大肠埃希菌,高产AmpC酶肺炎克雷伯菌,产AmpC铜绿假单胞菌分别46例,36例,21例.G+病原菌170例,其中金黄色葡萄球菌94例,表皮葡萄球菌36例,真菌27例.

2.2 小檗碱对产AmpC酶细菌的MIC情况经35℃培养18h后,选择比例较高的前三种细菌菌株在含不同浓度的小檗碱平板上培养,结果如表2.浓度为250g/L,125g/L,62.5g/L,31.25g/L的小檗碱对3种目标菌株都有不同的抑制作用,27例产AmpC酶大肠埃希菌MIC为浓度是31.25/L小檗碱,13例高产AmpC酶肺炎克雷伯菌的MIC为而浓度31.25/L小檗碱,12例产AmpC酶铜绿假单胞菌MIC为62.5/L小檗碱.浓度为15.62g/L的小檗碱基本对产AmpC酶细菌无抑制作用.

表1 伤口感染菌群分布情况

表2 小檗碱对产AmpC酶细菌的MIC结果

3 讨论

随着现代医疗技术的发展,各类手术治疗数量不断增多,术后切口感染也成了外科遇到的棘手问题之一,同时,由于抗生素的大量开发和术前过度性预防用药,导致了病人免疫功能紊乱和体内正常菌群失调,使手术患者者伤口感染率大大增加.在感染率增加的同时,细菌的耐药性也大幅提高.特别是β-内酰胺类抗生素的出现和滥用,增加了细菌β-内酰胺酶的产生和蔓延.β-内酰胺酶的产生,使单靶位作用的抗生素的疗效显著下降,在增加用药剂量的同时,增加了毒副作用,给外科手术治疗疾病带来了严重的威胁.由于受患者自身免疫状态、住院时间长短、手术创伤面大小、医院环境卫生条件及护理质量等原因的影响,近年来术后病人伤口感染的细菌种类也不断变化.表1显示,在本文研究的菌群分布中,G-杆茵占比例较大,主要是以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌为主,其中有48%的G-杆茵产生AmpC酶.

AmpC酶主要是由革兰阴性杆菌产生的一类β-内酰胺酶,是由细菌的染色体介导而产生,由位于染色体上的ampR,ampD,ampE和ampG等基因调控,并由ampC基因转录合成[3].AmpC酶主要可分为质粒型,诱导型和去阻遏突变型.质粒介导的AmpC酶经常在大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌、产气肠杆菌和奇异变形杆菌中持续高水平表达[4].细菌的AmpC酶耐药基因可以在质粒间及质粒与染色体间转移,也可通过转化、接合等方式转移给其他细菌,从而造成耐药性的传播.

有研究表明,无论单产AmpC酶还是单产ESBLs的菌株,对三代头孢菌素都表现出高度的耐药[5],而且,随着近年来我国抗生素的广泛使用,这种耐药性的传播也日益严重[6].因此寻找一种谱广抗菌,耐药率低,价格低廉的抗生素成为目前医学界当务之急.应用了两千多年的中药小檗碱,是从中药黄连、黄柏等植物中提取出来的异喹啉生物碱.其药理作用广泛,在临床上常用于抗肠道细菌感染疾病和清热解毒.它可作用于细菌(如大肠埃希菌:E.coli)的多个位点,未见导致明显的抗药性[7],而且具有价廉、易得、低毒等优点.它还具有抑制肿瘤转移、降低血糖和改善心脑血管功能等药效.

本研究的225株伤口感染细菌中,主要是以肠埃希菌和肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌为主,菌群的分布情况见表1.结果与国内的一些研究有一定的差异[6],这与目前抗生素滥用及其他原因而导致菌群的变化有关.从表2结果可以看出,产AmpC酶大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌的MIC分别是31.25g/L、62.5g/、62.5g/L的菌株最多.由此可见,不同浓度的小檗碱对产AmpC酶细菌都具有一定的抑制作用.另外,有报道小檗碱除了具有抗菌作用外,不易产生耐药性,副作用小等优点,还可以通过调节机体的免疫系统和改善机体微循环,从而达到清除病原菌的作用[8].有研究表明,如果小檗碱能与其他抗生素联合使用,效果更佳[9].因此,小檗碱应不失为目前临床上的一种治疗术后感染性疾病和防止细菌产生耐药性的一种良好药物.

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Inhibitory effects of berberine on postoperative AmpC enzyme producing strains

XU Jian,SITU Ruiru,LIN Yongping.The Maternal and Child Health Hospital of Haizhu District,Guangzhou 510220,China

ObjectiveTo investigate the pathogenic bacteria distribution in postoperative infection and the effects of berberine on the antibacterial effect of AmpC enzyme producing strains.MethodsThe bacteria producing AmpC enzyme were isolated from patients with postoperative infection,and the minimum inhibitory effects of berberine on the three kinds of isolates producing AmpC enzymes were detected by using the agar dilution method and broth dilution method.ResultsA total of 225 strains of G-Bacillus were isolated,46 strains of which producing AmpC enzyme,the MIC of 27 strains was 31.25g/L berberine; 26 strains of Klebsiella pneumoniae producing high AmpC,13 of which had MIC concentration of 31.25g/L berberine;21 strains of Pseudomonas aeruginosa producing AmpC,12 strains of which had MIC concentration of 60.25g/L berberine.The concentration of 15.62g/L berberine had no inhibitory effect on bacteria producing AmpC enzyme.There were 170 strains of G+pathogen,including 94 cases of Staphylococcus aureus,36 cases of Staphylococcus epidermidis and 27 cases of fungus.ConclusionG-coli producing AmpC enzyme in postoperative infections are more common,and the berberine has some antibacterial effect on bacterial strains producing AmpC enzyme.In order to reduce the abuse of antibiotics and cause multiple drug resistance,it is worthy of clinical application.

Postoperative infection;Berberine;AmpC enzyme;Antibacterial effect

R446.5,Q939.92

A

1674-1129(2014)03-0243-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.004

2013-10-25;

2014-04-17)

广东省科技厅社会发展领域科技计划项目(编号: 20120318025);广州市卫生局资助项目(编号:2009-BY-40)

徐剑,男,1971年11月出生,副主任医师,硕士研究生学历,主要从事外科学和感染性疾病的研究.

司徒瑞儒,男,1972年3月出生,主任技师,学士学位,主要从事临床检验工作.