应用胚胎皮肤细胞修复小鼠皮肤缺损的实验研究

郭相凯韩志华段惠川钱德检郗林鹤孟飞刘炬王彦

应用胚胎皮肤细胞修复小鼠皮肤缺损的实验研究

郭相凯韩志华段惠川钱德检郗林鹤孟飞刘炬王彦

目的探索胚胎皮肤细胞修复小鼠背部皮肤缺损的疗效。方法建立小鼠皮肤损伤模型，将小鼠胚胎皮肤的细胞植入小鼠皮肤损伤处（Nor-T组，n=6），与不作处理的小鼠（Nor组，n=6）进行皮肤损伤愈合的比较。分别在术后第1、2、3周采集标本，比较Nor-T组与Nor组创面愈合的情况，以免疫组织化学方法检测各组愈合过程中，TGF-β1和TGF-β3因子的表达情况。结果术后第1周，Nor-T组在创伤处形成再生皮肤覆盖创面；Nor组创面由痂皮覆盖；术后第2周，Nor-T组再生皮肤完全形成；Nor组瘢痕愈合。术后第3周，Nor-T组再生皮肤上生长出黑色毛发；而Nor组没有毛发生长。Nor-T组中，TGF-β1在术后第1周表达阳性，TGF-β3在术后第2周表达阳性。结论胚胎皮肤细胞具有形成再生皮肤和修复皮肤缺损的能力。

胚胎皮肤细胞再生皮肤瘢痕形成

瘢痕治疗是临床一大挑战[1]。不同部位的瘢痕会导致患者肢体功能障碍、运动受限，以及容貌改变导致的心理障碍。研究表明，胚胎皮肤具有强大的再生修复能力，能够在受到创伤后重新形成新的皮肤，并具有功能完整的皮肤附件[2-3]。因此，我们拟利用孕17.5 d的小鼠胚胎皮肤细胞进行皮肤缺损修复的实验，为无瘢痕愈合研究提供可能性。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

DMEM培养液（Gibco公司，美国），0.02%中性蛋白酶（Roche公司，德国），0.05%胰蛋白酶（Gibco公司，美国），0.05%Ⅰ型胶原酶（Worthington公司，美国），CM-DIL、兔抗鼠TGF-β1（Abcam公司，美国），TGF-β3（Abcam公司，美国），HRP标记的羊抗兔二抗抗体（博士德公司，武汉），胎牛血清（HYCLONE公司，美国），链霉素、青霉素（Gibco公司，美国)。

1.2 实验动物

8周龄雄性C57小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司），随机分为实验组和对照组（n=6）。本实验遵守实验动物福利伦理原则。

1.3 获取胚胎皮肤的细胞

孕17.5 d的C57小鼠脱颈处死后，剖腹取出胚胎（共30只），取胎鼠背部皮肤，剪成1 mm×1 mm大小，PBS浸洗2遍，加入0.02%Dispase，置于4℃冰箱中消化12 h，分离得到表皮和真皮层。将真皮组织剪成肉糜状后，0.05%Ⅰ型胶原酶重悬，置37℃摇床中消化1 h，然后将细胞悬液以40 μm单细胞滤器过滤，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，以含有10%FBS的DMEM培养液重悬细胞，待后续实验时使用。同时，将分离得到的表皮组织剪成肉糜状，0.05%胰蛋白酶重悬，置37℃摇床中消化10～15 h，含血清DMEM培养液终止消化，细胞悬液以40 μm单细胞滤器过滤，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，dK-SFM培养液重悬细胞，待后续实验时使用。

1.4 胚胎皮肤细胞的CM-DIL标记

将上述两种细胞悬液混合（ESkC），使用含20μmol CM-DIL的PBS重悬混合细胞，在37℃水浴中孵育5 min，然后将细胞悬液置于4℃冰箱中低温孵育30 min，促进CM-DIL在细胞膜上的着色。低温孵育后PBS清洗2遍，含血清的DMEM培养液重悬，待回植时使用。

1.5 动物模型的建立

C57小鼠麻醉成功后，使用直径9 mm的角膜环钻在小鼠背部制造一个圆形的全层皮肤缺损。创面旷置的小鼠作为对照组（Nor，n=6），使用ESkC细胞治疗的小鼠作为治疗组（Nor-T，n=6）。Nor-T组小鼠在皮肤创伤后使用5-0的尼龙线将硅胶小室固定在创伤处，将8.0×109个ESkC回植入皮肤缺损创面。实验时，将ESkC悬液在37℃、1 500 r/min条件下离心5 min，去上清液，吸取离心管底部的细胞回植入硅胶小室内，并完全覆盖皮肤创面（图1）。Nor组小鼠的创面直接使用凡士林和敷料覆盖，预防创面感染。术后小鼠分笼饲养，常规抗感染。

1.6 大体观察

术后第1、2、3周行大体观察，比较两组小鼠创面的修复情况。

1.7 组织学观察

术后第1、2、3周，在小鼠背部皮肤缺损修复处取材，所取皮肤包含2 mm宽的正常皮肤边缘。每个样本均使用Tissue-Tek OCT包埋、切片。

术后第1、2周,小鼠背部皮肤组织切片，使用兔抗鼠一抗TGF-β1（1∶200）、TGF-β3（1∶200）在4℃冰箱中低温孵育过夜。一抗孵育完成后，PBS洗去一抗，使用HRP标记的羊抗兔二抗抗体进行染色，在室温中孵育30 min。二抗孵育完成后，PBS洗去二抗，过氧化氢显色液显色，镜下观察TGF-β因子在组织中的表达情况。

术后第2周,小鼠背部皮肤组织切片，经染核荧光染料DAPI（1∶1 000，室温30 sec）染色后，在荧光显微镜下观察被CM-DIL标记的细胞存在情况。

术后第3周,小鼠背部皮肤组织切片行HE染色，比较两组皮肤缺损处的愈合情况。

2 结果

2.1 Nor-T组愈合效果优于Nor组

移植术后第1周，Nor-T组创面已经被再生皮肤覆盖，而Nor组创面由炎性渗出物形成的痂皮覆盖；术后第2周，Nor-T组再生皮肤完全形成，Nor组伤口愈合处形成一白色瘢痕；术后第3周，Nor-T组再生皮肤上生长出黑色毛发，而Nor组的伤口愈合处仍为瘢痕，没有毛发生长（图2）。HE染色结果显示，Nor-T组再生皮肤中有正常的毛囊组织形成，而Nor组没有毛囊等附件形成（图3）。上述结果表明，Nor-T组形成了再生皮肤并修复了皮肤缺损，而Nor组创面形成瘢痕愈合。

再生皮肤组织切片的荧光显微镜检测结果显3示，标记红色荧光标志物CM-DIL的ESkC细胞出现在再生皮肤中，参与了皮肤组织的再生（图4）。2.2TGF-β因子在Nor-T组愈合过程中的表达

术后第1周，TGF-β1和TGF-β3在两组中有相似的表达，TGF-β1阳性表达，而TGF-β3阴性表达；术后第2周，TGF-β1在两组中均表达下降，TGF-β3在Nor-T组中局部表达增加，在Nor组中表达量少。以上结果说明胚胎皮肤细胞表达TGF-β3，即实验组中胚胎皮肤细胞参与了创面的愈合（图5）。

图1小鼠治疗模型Fig.1The mouse treatment model

图2各组创面愈合情况Fig.2The observation of the wound healing of each group

图3术后第3周各组创面组织学观察Fig.3The histological observation of the wounds in each group 3 weeks after operation

图4 CM-DIL标记的ESkC细胞的观察Fig.4The observation of ESkC labeled by CM-DIL

图5 免疫组织化学检测各组TGF-β1及TGF-β3在术后1周、2周的表达情况Fig.5The expression of TGF-β1 and TGF-β3 in each group by immunohistochemistry 1 and 2 weeks after operation

讨论

有文献报道，胚胎皮肤细胞可修复皮肤缺损并构建毛囊等皮肤附件[4-5]，提示胚胎皮肤细胞具有再生能力。因此，我们应用小鼠胚胎皮肤细胞进行小鼠皮肤缺损的修复，观察其修复效果。

研究表明，在孕14.5 d时，小鼠胚胎皮肤由未分化的单层上皮细胞发育而来[6]；在孕17.5～18.5 d时，信号调节毛发向下生长，形成毛芽，初级毛囊形成[7]。因此，孕17.5～18.5 d的胚胎皮肤细胞能够用来构建新生皮肤和毛囊。胚胎皮肤可无瘢痕愈合，并正常发育形成皮肤附件结构。本实验中，术后第2周，治疗组再生皮肤完全形成，而对照组瘢痕愈合，证实了小鼠胚胎皮肤细胞具有修复皮肤缺损的能力。

TGF-β1是创面愈合过程中重要的细胞因子，在细胞外基质的形成和沉积、细胞增殖中扮演重要角色。在创面愈合过程中，TGF-β1的表达参与调控许多因子，如VEGF、EGF、PDGF和IGF等[8-9]。胚胎期和出生后的创面愈合过程中，产生的TGF-β比例不同。研究发现，TGF-β3在胚胎无瘢痕愈合过程中形成水平较高，但在成人的皮肤创面中TGF-β1的表达较高[10]。Ferguson等[11]报道，通过在抗体中加入TGF-β1或TGF-β2，或外源性应用TGF-β3能够促进无瘢痕愈合。我们的免疫组化结果显示，不同亚型的TGF-β因子在不同伤口愈合时期表达情况不同。

本实验中，胚胎皮肤细胞首先分泌促增殖因子促进细胞增殖；之后分泌促分化的因子诱导细胞的分化，其中也包括诱导附件的形成。尽管胚胎皮肤细胞是表皮和真皮细胞相互混合而成的，但在1周内形成了再生皮肤完整正常的皮肤结构和毛囊。

本实验利用胚胎皮肤细胞有效修复了小鼠皮肤创面，再生皮肤覆盖创面形成新的皮肤屏障。因此，胚胎皮肤细胞可能为皮肤损伤愈合，尤其是无瘢痕愈合的研究提供了新的思路。

[1]Falanga V.Wound healing and its impairment in the diabetic foot[J].Lancet,2005,366(9498):1736-1743.

[2]Liechty KW,Adzick NS,Crombleholme TM.Diminished interleukin 6(IL-6)production during scarless human fetal wound repair[J].Cytokine,2000,12(6):671-676.

[3]Liechty KW,Crombleholme TM,Cass DL,et al.Diminished interleukin-8(IL-8)production in the fetal wound healing response[J].J Surg Res,1998,77(1):80-84.

[4]Kataoka K,Medina RJ,Kageyama T,et al.Participation of adult mouse bone marrow cells in reconstitution of skin[J].Am J Pathol,2003,163(4):1227-1231.

[5]Toyoshima KE,Asakawa K,Ishibashi N,et al.Fully functional hair follicle regeneration through the rearrangement of stem cells and their niches[J].Nat Commun,2012,3:784.

[6]Fuchs E.Scratching the surface of skin development[J].Nature, 2007,445(7130):834-842.

[7]Sennett R,Rendl M.Mesenchymal-epithelial interactions during hair follicle morphogenesis and cycling[J].Semin Cell Dev Biol, 2012,23(8):917-927.

[8]Frank S,Hubner G,Breier G,et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes. Implications for normal and impaired wound healing[J].J Biol Chem,1995,270(21):12607-12613.

[9]Frank S,Madlener M,Werner S.Transforming growth factors beta1,beta2,and beta3 and their receptors are differentially regulated during normal and impaired wound healing[J].J Biol Chem,1996,271(17):10188-10193.

[10]Shah M,Foreman DM,Ferguson MW.Neutralisation of TGF-β1 and TGF-β2 or exogenous addition of TGF-beta 3 to cutaneous rat wounds reduces scarring[J].J Cell Sci,1995,108(Pt 3):985-1002.

[11]Ferguson MW,O'Kane S.Scar-free healing:from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2004,359(1445):839-850.

The Application of Embryonic Skin Cell in Repairing Skin Defect of Mouse

GUO Xiangkai1,2,5,HAN Zhihua3,DUAN

Huichuan3,QIAN Dejian4,XI Linhe5,MENG Fei5,LIU Ju6,WANG Yan5.1 Shangdong Academy of Medical Sciences, Shandong 250062,China;2 School of Medicine and Life Sciences,University of Jinan-Shangdong Academy of Medical Sciences,Shandong 250022,China;3 Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai 200011,China;4 Department of Trauma and Emergency Surgery,Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University,Shandong 250014,China;5 Department of Plastic Surgery,Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University, Shandong 250014,China;6 Medical Research Center,Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University,Shandong 250014,China.Corresponding author:WANG Yan(E-mail:wangyandr@126.com).

ObjectiveTo explore the efficacy of repairing skin defect of mouse by using embryonic skin cell.Methods Animal model of back skin damage in mice was built.The embryonic skin cells were transplanted into the back skin damage of mice as treatment group(Nor-T group,n=6)and the mice in control group(Nor group,n=6)were received no treatment. The wound healing situation were observed 1,2 and 3 weeks after operation.The expression of TGF-β was detected 1 and 2 weeks after operation.ResultsThe regenerative skin growth was observed on the wound area in Nor-T group,while only crusta was observed on the wound area in Nor group 1 week after operation.The regenerative skin merged with surrounding skin in Nor-T group,while the wound healed with scar in in Nor group 2 weeks after operation.The hair was observed in Nor-T group,while no hair was observed in Nor group 3 weeks after operation.In Nor-T group,TGF-β1 was expressed 1 week after operation and TGF-β3 was expressed 2 week after operation.ConclusionThe embryonic skin cells possess the ability of regenerative skin formation,and TGF-β has different expression at different wound healing phase.

Embryonic skin cell;Regenerative skin;Scar formation

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）02－0073－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.003

2014年1月26日；

2014年3月5日）

山东省科技发展计划项目（2011GSF11839）；山东省自然科学基金（ZR2009CQ001）。

250062山东省济南市山东省医学科学院（郭相凯）；250022山东省济南市济南大学，山东省医学科学院医学与生命科学学院（郭相凯）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院（韩志华，段惠川）；250014山东省济南市山东省千佛山医院创伤急诊外科（钱德检）；250014山东省济南市山东省千佛山医院整形外科（郗林鹤，孟飞，王彦）；250014山东省济南市山东省千佛山医院医学研究中心（刘炬）。

王彦（E-mail：wangyandr@126.com）。