黄参胡萝卜凝固型复合酸乳工艺优化

王晓琴，李方友，高旭峰，郑秀芳，金有银，卢雅兰，张芬琴*

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

黄参是伞形科迷果芹（Sphallerocarpus gracilis）的肉质根茎，俗称野胡萝卜，黄参富含蛋白质、黄酮、多糖和类胡萝卜素及人体必需的多种氨基酸和丰富的矿质元素[1-2]；黄参是一种药食兼用的极具开发前景的特色野生植物资源，不仅有独特的风味和营养，而且还有一定的保健和疗效作用[3-7]。胡萝卜具有“小人参”之美称，通常为一年生，伞形科草本植物[8]。胡萝卜营养价值很高，来源广泛且价格低廉，含有丰富的β-胡萝卜素（即VA原）、锌、铁、钙等元素和膳食纤维[9]。胡萝卜具有许多功效，如益肝明目、通便、防癌、降压降脂和增加人体免疫力等[10-12]。它是一种对人体健康非常有益的食品[9]。

凝固型酸乳以口感好、酸甜可口、营养丰富被广大消费者认可。近年来，研究者们将一些功能性配料添入凝固型酸乳中，开发出营养价值更高的新型酸乳。如权美平[13]研发了添加杏仁等的酸乳，陶伟双等[14]研发了添加银耳的酸乳，陈默等[15]研发了添加山药的酸乳，王蔚新等[16]研发了添加大豆的凝固型酸乳。这些添加物不仅拓宽了酸乳的花色品种，而且增强了传统酸乳的营养，具有很好的保健作用。

本实验以黄参和胡萝卜为材料，采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnke试验设计对黄参胡萝卜凝固型复合酸乳工艺参数进行优化；对影响酸乳口感的关键因素进行了研究，从而确定酸乳的原料要求，既能节约生产成本，又不影响酸乳口感；促进黄参和胡萝卜复合功能食品加工可持续发展，此产品不仅丰富了市场酸乳制品的花色，并且为胡萝卜和黄参的发展提供了新的途径；为河西地区乳品企业产品创新、拓宽酸乳的品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄参采样于甘肃山丹县；永昌胡萝卜选用新鲜、匀称、颜色鲜亮、肉厚、饱满、无虫蛀、无明显沟痕和分叉的新鲜胡萝卜；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb.）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St.）混合菌种（1∶1）由河西学院农业与生物技术学院微生物实验室经试验筛选、培养驯化而得；鲜牛乳 甘肃省张掖市鑫源乳业公司；蔗糖、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、黄原胶均为食品级。

1.2 仪器与设备

TGL-220型冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；CL-30L全自动高压灭菌锅 日本ALP公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；PHS-2F数字pH计 上海雷磁仪器厂；A-260盖勃氏乳脂计 沧州高密分析仪器厂；AE200电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MJX-160恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司；SW-CJ-ID超净化工作台 苏州净化设备厂；SMART光学显微镜 北京泰克仪器有限公司；SY-6型榨汁机 九阳股份有限公司；OSU-4L脉冲电场杀菌设备 美国俄亥俄州立大学。

1.3 方法

1.3.1 Plackett-Burman试验设计

表1 Plackett-Burman试验设计因素水平Table1 Factors and levels used for Plackett-Burman design

采用Plackett-Burman两水平法对影响黄参胡萝卜凝固型复合酸乳发酵的8个因素进行考察，每个因子取高（1）和低（－1）2个水平，响应值为沉淀率（Y）。筛选影响黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率的主效因素，试验因素水平及编码见表1。

1.3.2 最陡爬坡试验

响应面拟合方程只有在考察的邻近区域里才能充分近似真实情况，所以先逼近最大沉淀率区域后才能建立有效的拟合方程。根据Plackett-Burman试验筛选出显著因子，进行最陡爬坡试验，以期寻找到沉淀率。

1.3.3 响应面试验设计

根据Box-Behnken设计原理[17-18]，对Plackett-Burman试验确定的主效因和最陡爬坡试验确定的因素水平的中心点，取三水平作相互作用，确定最优组合，试验因素水平及编码见表2。

表2 Box-Behnken试验因素水平及编码表Table2 Codes and levels of factors used for Box-Behnken design

1.3.4 工艺流程

胡萝卜→清洗→切片→护色→榨汁→过滤→胡萝卜汁 黄参浆←过滤无菌灌装←打浆←去皮←灭菌←选料←黄参

鲜牛奶→预热→加糖→混合调料（胡萝卜汁、黄参浆）→灭菌（90℃、5 min）→冷却→接种（加入发酵剂←扩大←活化←菌种）→无菌灌装（杀菌后无菌灌装至已灭菌的玻璃瓶内）→保温发酵→冷却后酵（24 h）→成品→检验

1.3.5 胡萝卜汁的制备

选取新鲜、匀称、颜色鲜亮、无虫蛀、无明显沟痕和分叉的新鲜胡萝卜，用流水冲洗去除泥土等杂质，用质量分数2%氢氧化钠溶液（90℃）浸泡1～2 min[19]，后置于流动清水中清洗，用pH值试纸测试呈中性为止。将胡萝卜切分成0.5～1 cm厚的薄片，按料液比1∶3（m/V）护色（用质量分数0.03%抗坏血酸），漂烫5 min，待降温至60～70℃榨汁。将榨出的汁液用8 层无菌脱脂纱布过滤2次，在4 000 r/min条件下离心15 min，分离浆液后，取上清液，冷藏备用。

1.3.6 黄参浆的制备

参照文献[20]选取无明显沟痕、完整干净的新鲜黄参，快速用流水冲洗干净。在相对于黄参体积10倍的蒸馏水中将质量分数3%的白砂糖溶解，再将黄参浸入其中，用封口膜封好；85℃高压蒸煮，20 min后去皮榨浆备用。

1.3.7 发酵剂的制备

以体积分数3%～4%的比例将保存的液体菌种接入灭菌乳中，42℃培养12～24 h，冷却后置于4℃冰箱中保存。传代3次，菌种可达正常活力，制得母发酵剂，冷藏备用。

1.3.8 菌种驯化

将活化后的混合菌种接种于胡萝卜汁和黄参浆1∶2（m/m）再加鲜牛奶的培养基中，培养温度39℃、培养时间6 h逐步驯化（三代）后，稳定提高菌种活力，繁殖速度加快，即进行扩大培养。

1.3.9 黄参胡萝卜凝固型复合酸乳的工艺操作要点

1.3.9.1 预热、调配、灭菌及接种

将检验合格的原料乳预热至60℃时加入6%～8%的白砂糖，加热至90～95℃，保温5 min。降温至70℃，搅拌后加入黄参浆和胡萝卜汁，再搅拌，继续加热至70℃后保持2 min；降温至45℃，在无菌条件下，将发酵剂充分搅匀按接种量为3%～5%加到混合乳中，搅拌5 min均匀，灌装发酵。

1.3.9.2 保温发酵及冷藏

在43℃条件下进行保温发酵，待完全凝乳后停止发酵，将发酵后的产品迅速冷却至10℃以下，然后置于0～4℃的环境中后发酵24 h，经检验合格后即为成品。

1.3.10 测定方法

乳酸菌计数：按GB/T 4789.35—2010《食品卫生微生物学检验：食品中乳酸菌检验》规定的方法检验[21]。

总固形物、酸度、脂肪：按GB/T 5413.39—2010《乳与乳制品卫生标准的分析方法》规定的方法检验[22]；蛋白质：按GB/T 5009.52—2010《食品中蛋白质的测定》规定的方法检验[23]。

持水力：取5 mL的样品离心后除去上清液，使离心管保持倒置状态10 min。结束后立即称量[24]。计算公式如下：

沉淀率的测定[25]：准确称取样液5 mL于离心管中，3 000 r/ min离心10 min，去除上清液，准确称取沉淀质量，计算沉淀率，公式如下：

1.3.11 微生物指标检测

大肠菌群和致病菌：按GB/T 19302—2010《食品卫生微生物学检测：乳与乳制品检验》规定的方法检验[26]。

2 结果与分析

2.1 影响黄参胡萝卜凝固型复合酸乳发酵重要影响因素的筛选

Plackett-Burman试验设计及结果见表3。利用软件Design-Expert 8.0.5.0对Plackett-Burman试验结果进行方差分析，各因素的影响效果见表3，由表3可见，x5（黄参浆添加量）、x2（胡萝卜汁添加量）、x6（加糖量）和x7（发酵剂添加量）对沉淀率的影响最为显著，而且4个因素的效应值为正，而其他因素对沉淀率影响较小，故在下一步响应面分析中只考察4个因素最优水平。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果Table3 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡试验确定因素水平

表4 Plackett-Burman试验参数估计表Table4 Coefficient estimates of PB design

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table5 Results of steepest ascent design%

由表4关键因素效应可以看出，要使黄参胡萝卜凝固型复合酸乳稳定、感官质量好、沉淀率最佳[27-28]，应该提高黄参浆添加量、胡萝卜汁添加量、加糖量和接种量，沉淀率可以快速、准确地判断所添加稳定剂的含量在含乳饮料体系中应用的可行性，为生产和科研提供理论依据[29]。根据上述4个关键因素效应的大小比例设定它们的变化方向及步长进行的试验设计及结果见表5，随着4个重要因素的不同变化，沉淀率的变化趋势是先上升后下降，其中在3号水平上达到最大值，由此可知，最佳沉淀率分在3号水平附近，选此水平为中心点作为后续的响应面设计。

2.3 Box-Behnken试验设计及结果

取爬坡试验表5中的3号试验条件作为响应面试验因素水平的中心点进行响应面试验设计。以四因素三水平进行响应面试验，Box-Behnken试验设计及结果见表6。

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table6 Design and results of Box-Behnken experiments

Box-Behnken试验设计中对试验结果进行拟合的二次模型方差分析见表7，回归方程中各变量对响应值影响的显著性由P值来判定，概率P值越小，则相应变量的显著性越高[30]。利用软件Design-Expert 8.0.5.0对表中的试验数据进行多元回归拟合，得到编码空间二次函数模型为：Y=44.49+0.052A－2.89B－1.96C+0.32D－0.38AB－2.74AC－3.04BC－9.89A2－12.10B2－8.88C2－9.06D2，方差分析及F检验结果列于表8。

表7 Box-Behnken试验方差分析及显著性检验Table7 Significance test and variance analysis of Box-Behnken experiments

表8 回归模型系数显著性检验Table8 Significance test for each item in the regression model

多元回归模型拟合度采用R2表示，以R2＞0.9判定为优[31]。软件分析的多元拟合系数为R2=0.986 6，说明模型对试验实际情况拟合较好；预测R2=0.929 9，模型的校正决定系数R2=0.973 2，说明该模型能解释97.32%响应值的变化；由表7可知，本模型拟合程度明显，其F值为73.74，P值小于0.000 1，说明模型极显著；可用来进行响应值预测。根据模型失拟项P值为0.165 5＞0.05，不显著，说明模型中不需要引入更高次数的项，模型选择合适。所以，可以使用该模型来分析响应值的变化。从表8还可以看出因素一次项（A、B、C、D）、二次项（A2、B2、C2、D2）对结果影响是极显著的，交互项AC、AD、BC、BD对结果影响也极显著。

2.4 响应面互作效应分析与优化

从Box-Behnken试验方差分析的显著性检验可以看出，黄参浆添加量（A）和发酵剂添加量（D）的互作效应对黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率影响明显（P＜0.05），通过Design-Expert 8.0.5.0软件作其响应面曲线图。图1分别为4组以黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率为响应值的趋势图，可以更直观地反映出两变量交互作用的显著程度。

由图1可以看出，响应值存在最大值，通过软件分析计算，得到黄参胡萝卜凝固型复合酸乳预测值最大时的工艺参数为黄参浆添加量4.98%、胡萝卜汁添加量9.72%、加糖量7.13%、发酵剂添加量4.05%，此条件下发酵3.5 h，预测值为44.83%。考虑到实际配制的方便，将各因素条件修正为黄参浆添加量5%、胡萝卜汁添加量10%、加糖量7%、发酵剂添加量4%，在此条件下发酵3.5 h。黄参胡萝卜凝固型复合酸乳稳定性最好，在修正条件下对试验结果进行3次重复验证实验，黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率为45.29%。与理论预测值吻合得很好，表明模型合理有效。

2.5 酸乳品质检测结果

表9 理化指标Table9 Physical and chemical propertiess of yoghourt

表10 微生物指标Table10 Microbiological indexes of yoghourt

3 结 论

3.1 通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验对影响黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率及工艺条件进行筛选，发现对黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率影响显著的因素有黄参浆添加量、胡萝卜汁添加量、发酵剂添加量和加糖量，而其他因素在试验设定的范围内影响不显著。

3.2 通过对拟合二次回归模型方差分析，发现黄参浆添加量和加糖量、黄参浆添加量和发酵剂添加量、胡萝卜添加量和加糖量、胡萝卜添加量和发酵剂添加量的互作效应对黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率影响明显。

3.3 通过Box-Behnken试验设计及响应面分析获得的最佳工艺参数为黄参浆添加量4.98%、胡萝卜汁添加量9.72%、加糖量7.13%、发酵剂添加量4.05%，在此条件下发酵3.5 h，黄参胡萝卜凝固型复合酸乳沉淀率为 44.83%。实测值为45.29%，与理论预测值相比误差小于1%。因此，利用响应面分析方法对黄参胡萝卜凝固型复合酸乳的工艺条件进行优化，可以获得最优的工艺参数，能有效地减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的实验研究提供参考。

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