MMP-3在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达与临床意义的相关性研究

鲁明良 何瑾

（中国人民解放军第117医院肛肠外科 浙江杭州 310004）

结直肠癌是一种严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一［1］。世界范围的流行病学调查资料表明，在各类恶性肿瘤中，结直肠癌的发病率排在第三位，年度新增病例高达57万［2］。结直肠癌的发生是结肠黏膜上皮受遗传和环境等多种因素作用导致多基因改变的结果，其最早变化是隐窝细胞生长失调呈高增生状态，随着细胞的增生、堆积，隐窝增生区的上移，可逐渐形成向肠腔突出的肿块（息肉），肿瘤细胞浸润基底膜便发展为癌，进一步发展可出现转移。从正常结直肠黏膜—结直肠腺瘤—结直肠腺癌这一癌变过程中，其许多癌基因和抑癌基因发生改变，其中基质金属蛋白酶MMP-3表达异常。本文主要致力于MMP-3与结直肠癌的相关性的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 结直肠腺瘤组织20例及原发性结直肠癌60例均选自本院及全军肛肠研究所2000年1月至2010年12月手术切除并经病理证实的石蜡包埋组织标本，所有病例均有完整的随访资料。60例结直肠癌中，男33例，女27例；年龄20～75岁，平均52.88岁；发生部位结肠19例，直肠41例；根据1989年WHO肿瘤组织学分类：高、中、低分化各20例；侵及肌层以上者34例，侵及浆膜和＼或浆膜以外器官26例；有淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者37例；Dukes分期中A期19例，B期13例，C期23例，D期5例；生存期大于5年者32例，小于5年者28例。每例标本均经HE切片再次复查认定。所有的标本行约4μm厚的连续切片4张，分别做HE染色，免疫组化MMP-3染色。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人MMP-3单克隆抗体浓缩液（克隆号1B4）及SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒均为北京中山生物技术公司产品。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机、烤片箱、微波炉、37℃水浴箱，光学显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 H-E染色

1.2.2 免疫组化染色步骤 （1）载玻片处理。载玻片清洗干净后，放入70%乙醇-1%盐酸浸泡48h，蒸馏水冲洗，烤箱内烘干。10%多聚赖氨酸涂片，风干过夜。（2）石蜡切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温孵育5～10min，以清除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，浸泡5min。（3）微波抗原修复，pH6.0枸盐酸盐缓冲液95℃、15min，室温孵育10 min。10%正常羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加1抗（三种抗体1∶50稀释），4℃过夜。（4）PBS液冲洗，5min×3次；滴加生物素标记的二抗工作液，37℃温箱孵育30min；PBS液冲洗，5min×3次；滴加链霉素抗生素—过氧化物酶连接物，室温孵育30min；PBS液冲洗，5min×3次。（5）DAB显色，常温1～5min，显微镜下控制显色；自来水充分冲洗，苏木素复染、脱水、透明、封片，光镜观察。

1.3 结果判定 MMP-3定位于细胞浆，根据阳性细胞所占比例分为：阳性细胞≤5%或细胞无棕色颗粒与背景一致为“-”；阳性细胞≤50%为“＋”；阳性细胞＞50%为“＋＋”。根据阳性细胞染色强度分为：阴性为“-”；阳性为“＋”；强阳性为“＋＋”。

1.4 统计学处理 所得数据采用χ2检验，应用SPSS10.0统计软件，采用Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检验进行生存分析。

2 结 果

2.1 MMP-3在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达MMP-3在结直肠腺瘤中，阳性表达率为10%（2／20），阳性染色位于细胞浆，为棕黄色细颗粒状，以核顶部靠近腺体腔缘的胞浆明显，细胞核不着色；在结直肠癌中，阳性表达率为41.7%（25／35），阳性染色也位于细胞浆内，为弥漫性均质性棕黄色颗粒状，细胞核不着色。经卡方检验具有统计学意义（P＝0.031）。MMP-3在上述二者中除了在肿瘤细胞的胞浆中出现阳性表达外，部分细胞外基质也出现阳性染色，但明显较肿瘤细胞弱。MMP-3在结直肠腺瘤及结直肠癌中表达情况见表1。

表1 MMP-3在结直肠腺瘤与结直肠癌中表达（n）

2.2 MMP-3与结直肠癌的临床病理参数的关系MMP-3的阳性表达与淋巴结转移具有正相关性，即无淋巴结转移的37例中，MMP-3的阳性表达为11例，阳性表达率为29.7%；有淋巴结转移23例，MMP-3阳性表达14例，阳性表达率为60.9%，经卡方检验具有统计学意义（P＝0.017）。而与患者的发病年龄、性别、发病部位、肿物大小、分化程度、浸润深度、Dukes分期均无相关性（P＞0.05）。

2.3 MMP-3与结直肠癌生存期的关系 MMP-3表达的Kaplan-Meier生存曲线表明，MMP-3阳性表达组的五年生存状况比阴性组差，具有统计学意义（Log-rank检验，P＝0.003）。说明 MMP-3的表达与预后不良相关（见图1）。

图1 MMP-3表达的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

肿瘤的发生发展是一个复杂的生物学过程，它是细胞遗传物质异常的结果，同时也涉及机体的内环境中的各种因素，包括机体的免疫能力、各种生长因子和生物活性物质，而它们都是基因表达的结果，其中癌基因与抑癌基因的异常起着关键的作用。随着肿瘤分子生物学研究的进展，已发现多种基因及染色体异常与结直肠癌的发生、发展密切相关。

近年来，随着黏蛋白从CDNA文库中相继被克隆，以及大量的研究都证实了在肿瘤的发生发展中粘蛋白出现了质和量的改变，在肿瘤的浸润、转移中金属蛋白酶起到了非常重要的作用。本文主要研究基质金属蛋白酶MMP-3的表达，探讨其作为肿瘤的标志物用于结直肠癌诊断、分型、以及判断预后的价值。

基质金属蛋白酶在肿瘤的侵袭和转移过程中起着极为重要的作用。MMP在正常稳定状态组织中表达量极少，而且其释放、激活与抑制受到严格的控制，在肿瘤组织中，此平衡被打破，表现出对组织致命性的破坏，促进肿瘤细胞的浸润、转移。

据文献报道，MMP-3在结直肠癌中表达增加［3］。本研究结果表明，MMP-3在结直肠腺瘤中的阳性表达率为10%，在结直肠癌中的阳性表达率为41.7%，从结直肠腺瘤-结直肠癌这一发展过程中，MMP-3表达增加，与文献报道［4］相符，说明MMP-3参与了结直肠癌的发生。在结直肠癌中，MMP-3与分化程度、浸润深度、Dukes分期均无相关性。而与淋巴结转移呈明显的正相关。说明MMP-3可能参与了结直肠癌细胞的转移过程。其作用机理是MMP-3主要通过直接降解细胞外基质和基底膜成分，调节肿瘤细胞与基质的粘附，激活具有潜在活性的蛋白质等作用来促进癌细胞的转移［4］。

本文通过MMP-3表达的Kaplan-Meier生存曲线表明，MMP-3阳性组的5年生存率为33.3%，阴性组为68.6%，阳性组的生存状况明显比阴性组差，具有统计学意义（Log-rank检验，P＝0.003）。说明MMP-3的表达与预后不良相关。因此，通过检测MMP-3在结直肠癌中的表达，可以初步地判定淋巴结的转移情况，对估计患者的预后以及对临床治疗都起到了一定的指导作用。

本实验通过对基质金属蛋白酶MMP-3研究表明，MMP-3表达与结直肠癌的分化程度、浸润深度、Dukes分期均无相关性。MMP-3表达与淋巴结转移呈正相关，即有淋巴结转移者，阳性表达率高；无淋巴结转移者，表达率低。MMP-3阳性表达组的5年生存状况比阴性组差，是预后不良因子。因此，MMP-3参与了结直肠癌的发生、发展并影响了预后，对于临床上判断预后、指导治疗都有极其重要的作用。

［1］陈昊宾，王丽，李学峰，等.K-ras与大肠癌关系的研究进展［J］.西南国防医药，2010，20（3）：340-342.

［2］唐学洵，尉迟敏.大肠癌的临床筛选和早期诊断［J］.临床与哲学，1995，16（5）：267.

［3］Baker EA，Bergin FG，Leaper DJ.Br J Surg，2000，87（9）：1215-1221.

［4］Airola K，Karonen T，Valamo M，et al.Br Cancer，1999，80（6）：733-743.