血小板膜外周型苯二氮卓受体在初发脑梗死后抑郁中的作用*

陈 嫄， 陈春富， 李聪聪， 肖 萧

(山东大学附属省立医院神经内科，山东济南 250021)

血小板膜外周型苯二氮卓受体在初发脑梗死后抑郁中的作用*

陈 嫄， 陈春富△， 李聪聪， 肖 萧

(山东大学附属省立医院神经内科，山东济南 250021)

目的：观察卒中后抑郁(PSD)患者血小板膜外周型苯二氮卓受体(PBRs)的变化，探讨PBRs在PSD中的作用。方法：卒中后抑郁组为初发脑梗死后PSD患者43例、脑梗死组为初发脑梗死患者59例、对照组为健康献血者46名。采用Hamilton抑郁量表(HAMD)评定患者抑郁程度。提取外周血血小板膜，应用放射性配基［3H］PK11195结合实验测定PBRs特异结合活性。结果：［3H］PK11195结合活性3组之间有显著差异(P＜0.01)。与对照组［(298.2±25.1)pmol/(g protein)］比较，脑梗死组［3H］PK11195结合活性［(1 410.8±41.4) pmol/(g protein)］显著升高(P＜0.01)。与脑梗死组比较，PSD组［3H］PK11195结合活性［(361.7±30.6)pmol/g protein］显著降低(P＜0.01)。PSD组男性、女性患者之间比较，［3H］PK11195结合活性差异不显著。PSD组［3H］PK11195结合活性与患者病程无显著相关性(r=0.27，P＞0.05)，与HAMD评分呈显著负相关(r=-0.44，P＜0.01)。结论：PSD患者血小板膜PBRs结合活性下降，PBRs影响抑郁程度。

卒中后抑郁;脑梗死;外周型苯二氮卓受体;血小板

迄今，关于卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)的发病机制尚不清楚。中枢神经系统以外也存在苯二氮卓结合位点，被称为外周型苯二氮卓受体(peripheral-type benzodiazepine receptors，PBRs)，其结构、性质、功能与中枢型苯二氮卓受体均不相同，PBRs参与细胞呼吸，调节细胞增生，促进类固醇合成［1］。近几年来已经证实，PBRs变化与焦虑症、恐惧症、创伤后应激反应等多种神经症患者的临床症状有关，但对抑郁症与PBRs相关性研究报道较少，并且存在争议。卒中后神经症患者PBRs是否发生变化作者未见文献报道。本文观察首次发病的腔隙性梗死患者和PSD患者外周血血小板膜PBRs的变化，探讨PBRs在PSD中的作用。

材料和方法

1 研究对象

2005年12月至2008年3月住院的首次发病的腔隙性梗死患者102例，诊断依据1995年全国第四届脑血管病会议制定的脑血管病诊断标准，均经颅脑CT或MRI检查证实梗死灶大小约5～15 mm。排除诊断包括:①既往有脑卒中病史;②既往有抑郁发作史及其它精神障碍;③意识障碍;④痴呆或明显智能障碍;⑤失语;⑥存在脑叶皮质梗死;⑦存在静息性脑梗死;⑧合并代谢紊乱、中毒、感染以及严重心、肺、肝、肾和免疫功能异常或其它严重的急性期躯体疾病;⑨合并变性疾病、恶性病变、先天性代谢异常疾病、外伤、肿瘤、炎症或脱髓鞘等其它脑器质性疾病;⑩有企图自杀史者。进入本研究的病例中，PSD组43例，男29例，女14例，平均年龄(66.4±7.8)岁，病程3～72 h，平均(43.8±23.5)h。诊断依据《中国精神障碍分类与诊断标准第3版》(CCMD-3)。脑梗死组59例，其中男39例，女20例，平均(65.9 ±8.1)岁，病程3～72 h，平均(45.5±22.9)h。对照组46人来自健康献血者，其中男31例，女15例，平均(35.2±7.4)岁。3组间年龄差异有统计学意义(P＜0.01)，性别差异无统计学意义(P＜0.05)。PSD组与脑梗死组间病程差异无统计学意义(P＞0.05)。

2 主要药品和仪器

［3H］PK11195购自PerkinElmer Life Science，纯度97%，比活性83.5 Ci/mmol(3.09 TBq/mmol)。非标记PK11195和考马斯亮蓝均为Sigma产品。牛血清白蛋白为北京中山试剂公司产品，4℃保存。AvantiTMJ-3低温高速冷冻离心机和Rotor J-30.50、Rotor J-21转子均购自Beckman。

3 方法

3.1 神经功能缺损评定 用改良的爱丁堡-斯堪的那维亚神经功能缺损评分量表(the modified Edinburgh-Scandinavian stroke scale，MESSS)，最高分为45分，1～15分为轻型，16～30分为中型，31～45分为重型。

3.2 抑郁程度评定 采用 Hamilton抑郁量表(Hamilton depression rating scale，HAMD;17项版本)测量，HAMD总分＜8分为正常，≥8分为轻度抑郁，≥18分为中度抑郁，≥24分为重度抑郁。

3.3 血小板膜制备 上午8～9时取肘静脉血20 mL，用3.8%枸橼酸钠5 mL抗凝，离心(180×g，4℃)15 min，吸取上清液富含血小板血浆，离心(1 500×g，4℃)15 min，弃上清，在沉淀中加入20 mL Tris-HCl(10 mmol·L-1，pH 7.4)低渗缓冲液，4℃，1～2 h完成溶血，离心(12 000×g，4℃)20 min得沉淀，用等渗磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)重复洗涤2次，制得白色絮状物血小板膜，-80℃保存。

3.4 放射性配基结合实验［2］取血小板膜标本在室温下解冻，加入冰冷的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，混匀，每管调整蛋白质浓度约为1.0～2.0 g/L。取100 μL膜悬液，加入冰冷的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)200 μL，非特异结合管中加入非标记PK11195，终浓度为1 μmol/L，孵育10 min，然后每管加入［3H］PK11195 10 μL，终浓度5 nmol/L，每个样品均为双复管，在4℃孵育60 min，迅速真空抽滤到玻璃纤维素滤膜上，用20 mL冰冷的Tris-HCl缓冲液重复洗涤滤膜终止反应。滤膜移至5 mL闪烁液(PPO 5 g/L，POPOP 0.1 g/L，溶媒甲苯∶曲拉通100=2∶1加至1 000 mL)内。暗适应至少8 h以减少化学发光，于L9800液体闪烁计数仪(Beckman)上计数，每个标本计数1 min。受体特异结合计算公式:［总计数(min-1)-非特异性结合计数(min-1)］÷总计数(min-1)×［H3］PK11195物质的量(pmol)÷样品蛋白质量(g)。蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS 10.0统计软件分析。其中，性别差异用Χ2检验。计量资料多组比较以年龄为协变量，采用协方差分析，组间比较采用LSD法;两组病程及MESSS评分差异采用t检验。指标间相关性采用双变量偏相关分析方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 神经功能缺损及抑郁程度评分

PSD患者MESSS评分8～19分，平均(14.6± 3.4)分。HAMD总分17～27分，平均(21.8±4.5)分。脑梗死组MESSS评分8～21分，平均(12.8± 5.9)分。HAMD总分0～7分，平均(2.6±0.9)分。两组SSS评分比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2 血小板膜PBRs结合活性的变化

外周血血小板膜PBRs结合活性3组之间差异有统计学意义(P＜0.01)。与对照组［(298.2± 25.1)pmol/(g protein)］比较，脑梗死组［3H］PK11195结合活性［(1410.8±41.4)pmol/(g protein)］显著升高(P＜0.01)，PSD组［(361.7±30.6) pmol/(g protein)］显著升高(P＜0.05)。与脑梗死组比较，PSD组［3H］PK11195结合活性显著降低(P＜0.01)。

以年龄为协变量，PSD组男性［(355.4±33.2) pmol/(g protein)］、女性［(365.1±30.9)pmol/(g protein)］之间比较，［3H］PK11195结合活性差异无统计学意义(P＞0.05)。脑梗死组男性［(1 423.2± 53.2)pmol/(g protein)］、女性［(1 405.4±42.3) pmol/(g protein)］之间［3H］PK11195结合活性比较差异也无统计学意义(P＞0.05)。

3 相关性分析

以年龄为协变量，PSD组［3H］PK11195结合活性与患者病程无显著相关性(r=0.27，P＞0.05)，与患者HAMD总分显著相关(r=-0.44，P＜0.01);与HAMD因子抑郁情绪(r=-0.63，P＜0.01)、自杀(r=-0.67，P＜0.01)、入睡困难(r=-0.39，P＜0.01)、激越(r=-0.46，P＜0.01)、精神焦虑(r= -0.34，P＜0.05)、胃肠道症状(r=-0.31，P＜0.05)、全身症状(r=-0.32，P＜0.05)评分显著相关，与其它因子评分无显著相关性(P＞0.05)。

讨论

近几年来有关PBRs变化在焦虑症、恐惧症、创伤后应激反应中作用的报道有逐年增加趋势。1999年Soreni等［3］通过病例对照研究发现，与年龄、性别匹配的对照组比较，9例住院的自杀3次以上年轻患者血小板PBRs密度(Bmax)下降了35%，与其他学者对广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder，GAD)和创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)患者测得的结果类似，认为PBRs在人类自杀慢性应激反应中起着一定的作用。2005年Marazziti等［4］也发现自杀人群血小板［3H］PK11195结合密度显著低于健康对照组。由于PBRs受应激和激素的调节，所以作者认为自杀人群血小板PBRs密度下降可能是应激状态的非特异表现，另外可能源于与自杀倾向密切相关的甾体物质代谢异常。Johnson等［5］检查了53例广义社交恐怖症(generalized social phobia，GSP)患者血小板PBRs常数即Bmax和解离常数(Kd)，发现患者组PBRs Bmax显著低于对照组，提示PBRs与GSP有关。Gavish等［6］通过病例对照研究发现，与年龄、性别匹配的对照组比较，18例海湾战争PTSD患者血小板PBRs Bmax下降了62%，与其他学者对GAD患者测得的结果类似，认为PBRs下调是适应性反应，旨在防止在高度觉醒状态下糖皮质激素的慢性过度产生。Micale等［7］用高胆固醇饲料喂养Wistar大鼠2个月，连续14 d给各组大鼠腹腔注射异喹啉PK11195(1 mg/kg，qd)，发现饲以标准饲料的实验动物强迫游泳实验积分下降，高胆固醇饲料及标准饲料组动物均出现了焦虑症状。1991年Rocca等［8］发现强迫症(obsessive-compulsive disorder，OCD)患者血小板PBRs下降，但1993年Weizman等研究未发现 OCD患者血小板PBRs异常。Rocca等［9］认为上述结果上的差异与所选病例患者病程不同有关，他们再次利用受体结合方法和PCR技术检测发现，与10例健康对照比较，8例慢性OCD患者淋巴细胞PBRs Bmax以及PBRs mRNA明显减少，7例发作性OCD患者PBRs Bmax以及PBRs mRNA无显著变化。如果将慢性OCD患者和发作性OCD患者数据合并统计，与10例健康对照比较PBRs Bmax差异不显著。

迄今对于抑郁症与PBRs的相关性研究报道较少，尚缺乏PSD患者PBRs变化的文献资料。2001年Kurumaji等［10］检查了情感障碍患者PBRs基因2种错义突变情况，发现2种错义突变等位基因频率、基因型计数、单体型分布与双相性情感障碍(躁抑症)、抑郁症没有显著关系，认为PBRs未参与遗传性情感障碍易感性的发病机制。Nakamura等［11］利用PCR技术检查了对91例恐惧症(phobic disorder，PD)患者和178例对照者PBRs基因多态性，分析发现PD患者与对照间485G＞A(CGT→CAT)基因型(P＜0.05)和等位基因(P＜0.05)差异显著，提示PBRs基因变异影响PD易感性。Weizman等［12］观察了14例未经治疗的抑郁患者和13例健康人血小板PBRs的变化，发现2组间血小板PBRs Bmax和Kd无显著差异，Bmax与患者抑郁程度(HAMD积分、Beck抑郁量表积分)无显著相关性，与患者焦虑程度(Hamilton焦虑量表积分)也无显著相关性，由此认为严重抑郁有别于应激及某种焦虑症，与PBRs的变化无关。2008年Chelli等［13］观察了40例门诊抑郁患者血小板膜PBRs的亚单位——异喹啉结合位点(18 kD translocator protein，TSPO;PBRs的代名词)特异配基［3H］PK11195结合，发现与20例健康人比较，伴发分离性焦虑的抑郁患者TSPO密度显著下降，但无分离性焦虑的抑郁患者TSPO密度无显著变化。相关分析发现，TSPO密度与分离焦虑症状临床量表评分及分离焦虑症状自评量表积分显著相关，而与HAMD总分及HAMD分测验焦虑/躯体症状因子分无显著关系，表明TSPO过度表达有望成为分离性焦虑的生物学指标。近期利用大鼠、小鼠进行的一系列实验结果均证实，PBRs新型配基YL-IPA08具有抗抑郁和抗焦虑作用［14］。本研究3组间年龄比较差异有统计学意义，为此多组间PBRs比较以年龄为协变量采用了协方差分析，以便排除年龄这一混杂因素的影响。研究发现，PSD组［3H］PK11195结合活性显著低于病例对照脑梗死组，与HAMD总分显著相关，与患者病程无显著相关性，提示PBRs的变化参与了 PSD发病机制。相关分析结果显示［3H］PK11195结合活性主要影响自杀、抑郁情绪等靶症状，其次是激越、入睡困难，也影响精神焦虑、胃肠道症状及全身症状。一般认为，急性应激PBRs表达上调，慢性应激PBRs表达下降。鉴于此，推测PSD的应激反应可能系慢性应激类，除了脑部变化外，可能涉及其它脏器PBRs的变化，有待进一步研究。

综上所述，PSD患者血小板膜［3H］PK11195结合活性降低，与患者抑郁程度显著相关，提示PBRs有望成为PSD的生物学指标及药物干预的新靶点。由于所选病例基线资料参差不齐，未分析受体学参数的变化以及不同病变部位对［3H］PK11195结合活性的影响。同时因入组的新诊断病例数偏少，所以本研究结果尚需扩大样本量进一步验证。

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Effects of peripheral-type benzodiazepine receptors in platelet membrane on patients with depression after first attack of cerebral infarction

CHEN Yuan，CHEN Chun-fu，LI Cong-cong，XIAO Xiao
(Department of Neurology，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China.E-mail: chencf301@163.com)

AIM:To evaluate the changes of peripheral-type benzodiazepine receptors(PBRs)in platelet membrane in post-stroke depression(PSD)patients and to investigate the effects of PBRs on PSD.METHODS:Fortythree patients with PSD，fifty-nine patients with first-ever cerebral infarction and fifty-six healthy volunteers participated in this study.Platelet membrane in venous blood was prepared.Binding assay of the radioactive PBRs antagonist［3H］PK11195 to platelet membrane was performed.RESULTS:A significant difference of［3H］PK11195 binding was found among the 3 groups(P＜0.01).Compared with the healthy volunteers［(298.2±25.1)pmol/(g protein)］，a highly significant increase in［3H］PK11195 binding was observed in platelet membrane in the patients with first attack of cerebral infarction［(1 410.8±41.4)pmol/(g protein)，P＜0.01］.Compared with the patients with first attack of cerebral infarction，a significant reduction in［3H］PK11195 binding was detected in platelet membrane in the patients with PSD［(361.7±30.6)pmol/(g protein)，P＜0.01］.In the patients with PSD，no significant difference of［3H］PK11195 binding was found between men and women(P＞0.05).［3H］PK11195 binding was related to the score of Hamilton depression rating scale(r=-0.44，P＜0.01)but not to the duration of cerebral infarction(r=0.27，P＞0.05).CONCLUSION:PBRs binding activity in platelet membrane decreases in the patients with PSD and affects the degree of depression.

Post-stroke depression;Cerebral infarction;Peripheral-type benzodiazepine receptors;Blood platelets

R743.3;R749.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.028

1000-4718(2014)03-0543-04

2013-10-14

2014-01-07

山东省自然科学基金重点项目(No.Z2007C03)

△通讯作者Tel:0531-67886354;E-mail:chencf301@163.com