精子发生过程中的组蛋白变化与雄性不育

潘晓燕，李质馨，王正朝，王雪楠，黄冰洋，窦肇华，孙艳美

1吉林医药学院组织学与胚胎学教研室，吉林吉林 132013

2福建师范大学生命科学学院发育与神经生物学重点实验室，福州 350007

3济宁医学院附属医院生殖医学中心，山东济宁 272029

4吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013

·综 述·

精子发生过程中的组蛋白变化与雄性不育

潘晓燕1，李质馨1，王正朝2，王雪楠3，黄冰洋1，窦肇华1，孙艳美4

1吉林医药学院组织学与胚胎学教研室，吉林吉林 132013

2福建师范大学生命科学学院发育与神经生物学重点实验室，福州 350007

3济宁医学院附属医院生殖医学中心，山东济宁 272029

4吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013

男性不育的许多病理现象与生精细胞的表观遗传改变关系密切。表观遗传在精子发生过程中调控着生精细胞的有丝分裂、减数分裂和精子形成过程，其中，作为表观遗传的一个重要研究内容——组蛋白，在精子发生过程中会发生多位点和多种形式的氨基酸残基修饰，不同的修饰方式在精子发生的不同阶段精确地调控着生殖细胞的发育过程，且在精子形成阶段发生鱼精蛋白和组蛋白的替换。此外，在精子发生过程中，组蛋白修饰的异常改变还可能会损伤精子的发育过程，导致雄性不育。本文总结了精子发生过程中组蛋白修饰的变化、对生殖细胞发育的调控作用，以及组蛋白的异常改变与雄性不育的关系。

精子发生;组蛋白修饰;鱼精蛋白;雄性不育

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：108-113

目前，男性不育已成为困扰人们的一大难题，男性不育患者的比例也在逐年增加，约每20名男性中会有1名男性有生育问题［1］。尽管在男性不育症领域已进行了很多研究，但其发病机制仍然还不清楚。许多研究者认为是基因序列的变化引起了男性的不育，但对不育男性基因组DNA中的生殖相关基因进行测序的结果显示，基因序列没有发生明显改变［2-3］。精子的发生是一个高度调控的发育过程，已有研究表明表观遗传学机制参与了精子发生过程中许多重要事件的调控，如：染色体的凝集、精子发育相关基因的转录激活/抑制以及精子核DNA的高度包装等。如果在精子发生过程中这些调控机制发生紊乱，很可能会导致男性不育。

表观遗传学中一个重要研究方向是组蛋白修饰，通过对组蛋白的修饰可以调节组蛋白和DNA的结合程度，进而调控基因的转录。组蛋白的修饰主要发生在组蛋白尾的氨基酸残基上，这些氨基酸残基发生了甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等修饰［4-5］，这些翻译后的修饰改变了染色体的结构，使基因发生了转录激活或抑制。此外，在精子细胞形成精子的过程中还会发生鱼精蛋白和组蛋白之间的替换，通过鱼精蛋白对DNA的高度包装，使精子中的遗传物质能够稳定传递给卵母细胞［6］。目前越来越多的研究正逐渐阐明组蛋白在精子发生过程中的重要调控作用，以及组蛋白的异常变化可能引起的雄性不育。本文总结了精子发生过程中组蛋白发生的一系列变化以及组蛋白的异常改变与雄性不育的关系。

组蛋白氨基酸残基的修饰

雄性生殖细胞形成后，在有丝分裂和减数分裂期间DNA被组蛋白包装成核小体，组成核小体的组蛋白主要有4种类型：H2A、H2B、H3和H4。组蛋白的包装有利于精子发生过程中异染色质凝集状态和常染色质开放状态的形成。组蛋白由1个球形结构域和延伸的氨基酸尾组成，其中组蛋白的氨基酸尾残基能发生甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后修饰，这些组蛋白的化学修饰能独自或共同影响雄性生殖细胞基因转录的抑制或激活。

组蛋白的甲基化甲基化是组蛋白最常见的一种修饰方式，主要发生在组蛋白N-端的精氨酸和赖氨酸残基上。组蛋白的甲基化由组蛋白甲基化转移酶介导，赖氨酸残基可以发生单甲基化、二甲基化或三甲基化［4］，精氨酸或赖氨酸的甲基化参与了精子发生过程中基因转录的激活或抑制［7］。组蛋白去甲基化酶可以去除精氨酸或赖氨酸残基上的甲基化基团，改变组蛋白的甲基化状态。研究发现，组蛋白H3赖氨酸残基的甲基化在睾丸精原干细胞向精母细胞发育过程中起着非常重要的调控作用，在精原干细胞阶段H3K4的甲基化水平达到峰值，若H3K4失去甲基化，则导致精母细胞的发育数量显著减少［8］。相比之下，H3K9和H3K27在精原干细胞中处于较低的甲基化水平［9］，而在精母细胞减数分裂期间在睾丸组织中甲基化转移酶SUV39H1和SUV39H2的作用下，精母细胞异染色质区H3K9发生三甲基化。H3K9me3能使异染色质蛋白 HP1α、PPβ和 HP1γ募集到异染色质区［10］，随后使此区域的H4K20发生二甲基化和三甲基化，甲基化组蛋白和异染色质蛋白的结合形成了精母细胞异染色质区的一个转录抑制状态。SUV39H1敲除的小鼠出现精子发生过程受损、精母细胞在粗线期发生凋亡，影响了同源染色体的配对和联会复合体的形成［11］。此外，还发现在体细胞中使常染色质区H3K9发生单甲基化和二甲基化的组蛋白甲基化转移酶G9A在雄性生殖细胞减数分裂中也发挥重要作用。G9A敲除小鼠的精母细胞不能通过减数分裂粗线期，从而产生不育现象［12］。

组蛋白甲基化标志的建立与去除时间对正常的精子发生过程是必须的。在秀丽线虫减数分裂的中期到末期，敲除LSDI/KDMI(H3K4me的去甲基化酶)会导致生殖细胞的凋亡和不育［13］。在减数分裂结束时，H3K9甲基化的去除对于精子发生是必须的，若H3K9去甲基化酶JHDM2A的表达紊乱，则可造成鱼精蛋白1(protamine 1，PRM1)和过渡蛋白1(transition nuclear protein 1，TNP1)的表达缺失，染色体凝集障碍，从而导致雄性不育［14］。因此，组蛋白甲基化在不同发育时期通过不同机制调控着整个精子的发生过程。Hammoud等［15］比较了正常男性和不育男性精子中的整个组蛋白分布，发现在不育男性精子中H3K4me和H3K27me的定位与正常男性精子非常相似，但在一些发育转录因子和印记基因处的数量却显著减少，使得这些转录因子启动子区和印记基因印记区的甲基化状态被改变，影响了转录因子和印记基因的表达。Steilmann等［16］在可育男性精子中溴结构域睾丸特殊基因 (bromodomain testis-specific gene，BRDT)的启动子区发现了甲基化组蛋白的分布丰富，而在不育男性精子中BRDT启动子区甲基化的组蛋白数量显著减少，使BRDT mRNA水平显著升高，精子染色体凝集异常，长期累积的不良影响最终导致男性不育。

组蛋白的乙酰化组蛋白赖氨酸残基的乙酰化受组蛋白乙酰基转移酶 (histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylases，HDACs)的调控，组蛋白乙酰基转移酶能催化核心组蛋白N-末端的赖氨酸残基发生乙酰化，与基因激活有关［17］;而组蛋白去乙酰化酶能逆转HATs的作用，与基因沉默有关，这两种酶都是精子发生过程所必须的，它们所催化的H3和H4上赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化在精子发生过程中起了重要的调控作用。

在精原干细胞阶段H3和H4乙酰化处于较高水平，而到减数分裂期间这些乙酰化标志被完全去除，直至进入精子细胞伸长阶段，H3和H4又重新发生乙酰化［18］，在这一时期H4的超乙酰化使精子细胞染色体的包装变得松弛，这对于鱼精蛋白和组蛋白之间的充分替换是必须的［19］。在伸长的精子细胞中H3乙酰化依赖于Pygopus蛋白，该蛋白与三甲基化的H3K4结合有助于H3发生乙酰化［18］。在伸长的精子细胞中催化H4乙酰化的酶还不清楚，但在圆形精子细胞中发现了2个乙酰基转移酶CDY和MYST4，这2个酶定位于精子细胞核中，具有H4乙酰化酶的活性［20］，可催化圆形精子细胞中H4的乙酰化。在精子发生过程中，H2B的乙酰化以及调控其发生乙酰化的酶类研究很少。

精子的发生过程需要组蛋白乙酰化的精确调控，利用HDAC抑制剂TSA处理小鼠，显著减少了精子细胞的数量，引起小鼠的严重不育［21］，表明雄性不育很可能与组蛋白异常的乙酰化水平调控有关。而H4超乙酰化对于组蛋白和鱼精蛋白之间的替换是必须的。H4超乙酰化降低了精子组蛋白和DNA之间的亲和性，允许过渡蛋白与组蛋白之间的交换。Sonnack等［22］研究发现，不育男性精子细胞中H4乙酰化水平显著降低，与被损伤的精子发生有关。在圆形精子细胞成熟阻滞的不育男性生精小管中，大约60%的精子细胞对这种超乙酰化染色显示免疫阳性，且发现这些精子细胞中许多是多核的;对于产生正常精子数量的不育男性，大约90%的精子细胞显示免疫阳性;而对于产生不正常精子数量的不育男性，只有75%左右的精子细胞显示免疫阳性;在可育男性中几乎所有的圆形精子细胞都显示超乙酰化。有趣的是，在圆形精子细胞成熟阻滞的不育男性生精小管中的精母细胞显示出了超乙酰化，这提示H4的提早乙酰化很可能导致了核蛋白过早的过渡与随后的不育。

组蛋白的磷酸化组蛋白的磷酸化发生在组蛋白的丝氨酸残基上，通常与基因激活有关［7］。组蛋白变体H2AX的磷酸化 (也称为rH2AX)在精子发生过程中与减数分裂期间的基因沉默有关。H2AX磷酸化依赖于Rad3相关蛋白ATR和肿瘤抑制因子BRCAI的作用。rH2AX形成后与ATR和BRCAI一起启动了减数分裂性染色体的失活 (meiotic sex chromosome inactivation，MSCI)，但维持MSCI经过减数分裂粗线期还需要有其他表观遗传修饰的参与，如H2A的泛素化［23］。

组蛋白的泛素化泛素化是将泛素单体分子共价结合到组蛋白的赖氨酸残基上，组蛋白发生泛素化后可提高或抑制基因转录。H2A能发生单泛素化，参与雄性配子减数分裂期间的转录抑制;而H2B的单泛素化则与精子发生过程中的基因转录激活有关［24］。在雄性生殖细胞中rH2AX启动MSCI后，泛素化的H2A被募集到性体和端粒处，参与失活性染色体基因沉默的维持。H4在伸长的精子细胞中会发生多泛素化，从而有利于核小体的去装配［25］。若小鼠的泛素连接酶基因 (ubiquitin ligase gene，RNF8)表达紊乱，将诱导H4K16发生乙酰化，可导致在精子发生过程中核小体去组装不完全［26］，进而影响雄鼠的生育能力。

在精子发生过程中，组蛋白氨基酸残基不同的修饰方式表明表观遗传以不同的方式精确调控着精子发生过程，由于营养、环境、疾病等因素导致的组蛋白修饰的改变，很可能会影响精子的发生过程，导致雄性不育。因此，由于表观遗传改变而引起的生精障碍已成为目前研究雄性不育的热点问题。

鱼精蛋白取代组蛋白

在圆形的单倍体精子细胞形成成熟精子的过程中，除了胞质和细胞器发生明显改变外，染色质也会发生广泛的重塑，核高度凝集到转录抑制状态，保护精子中的遗传物质，使其在受精过程中完整地进入到卵母细胞中。在精子细胞核凝集的过程中需要发生组蛋白向鱼精蛋白的转变［27］，组蛋白先被过渡核蛋白(TNP1和 TNP2)替代，然后 TNPs又被鱼精蛋白(PRM1和PRM2)所取代。鱼精蛋白由高含量的带正电荷的氨基酸组成，尤其是精氨酸的含量约占人鱼精蛋白的48%，大多数哺乳动物具有2种形式的鱼精蛋白，PRM1和PRM2，能把DNA包装成一个高度紧密有序的状态。鱼精蛋白在结合到DNA之前处于磷酸化状态，其在核内的成熟过程中会发生广泛的去磷酸化［28］。成熟的鱼精蛋白与DNA结合后，鱼精蛋白分子之间形成的二硫键会进一步稳定该复合体的结构［29］。PRM1或PRM2基因表达紊乱将使精子核出现不规则的凝集状态、PRM2翻译后不被处理，最终导致公鼠不育［30］。

PRM1和PRM2在精子中有着严格的比例标准，偏离0．8～1．2这一比例标准，偏高或偏低都会影响精液的质量和精子DNA的完整性，降低精子的受精能力，导致男性不育［31］。在这些不育男性中，最常发生的是由于PRM2水平异常降低引起的PRM1/PRM2比例升高，甚至在一些不育男性精子中没有发现PRM2存在［31］。de Yebra 等［32］研究表明，高 PRM1/PRM2比例患者也很可能是由于鱼精蛋白水平降低与中间过渡蛋白水平升高所致。在生育能力正常的男性精子中目前没有发现有严重的PRM1/PRM2比例异常的现象，因此精子中PRM1/PRM2比例改变似乎是不育男性的一个重要特征［33］。最近发现，异常的鱼精蛋白水平与异常的基因印记之间有一定联系。Hammoud等［34］在具有异常鱼精蛋白水平的不育男性精子中发现印记基因KCNQ1、LIT1和SNRPN发生超甲基化，而H19则显示低甲基化，印记基因甲基化状态的改变会影响精子的正常功能。

鱼精蛋白的表达受H3K9me2/H3K9me1去甲基化酶JHDM2A的调控，该酶从粗线期晚期开始表达持续到精子细胞伸长期，精子中不含JHDM2A［14］。JHDM2A的功能是使圆形精子细胞中TP1和PRM1启动子区的甲基化H3K9发生去甲基化，若该酶缺失则使H3K9发生超甲基化，TP1和PRM1基因转录沉默，出现减数分裂后染色体凝集缺陷和异常的核结构，显著减少了精子的数量，造成雄性不育［14］。因此，TNPs和PRMs的正常表达和对组蛋白的替换是形成正常精子核的必要条件。

小结与展望

随着现代生物技术的快速发展，人们对表观遗传认识的日益深入，在精子形成过程中组蛋白变化方面的研究已经取得一定进展。在精子发生的每个阶段，在睾丸中特殊的组蛋白修饰酶的作用下精确地调控着组蛋白的修饰方式，调节着精子发生所需的相关基因的表达。由于组蛋白氨基酸残基修饰方式和修饰位点的多样性，极大提高了组蛋白修饰调节基因表达的复杂性，使得组蛋白修饰在精子发生过程中发挥着非常重要的调控作用。在整个精子发生过程中，不仅要发生多种形式的组蛋白氨基酸残基修饰，还要发生鱼精蛋白和组蛋白之间的替换。虽然大部分组蛋白被鱼精蛋白替换，但残留的少部分组蛋白在精子功能的维持和受精后胚胎的发育过程中仍发挥着非常重要的作用。目前，组蛋白在精子发生过程中的调控机制研究尚处于起步阶段，仍有许多问题亟待解决，如组蛋白修饰与其他表观遗传修饰 (DNA甲基化、基因组印记和RNA沉默)的关系、组蛋白异常修饰的累积效应可能导致的男性生育力低下及组蛋白异常修饰传给子代的可能性和风险等。这些问题的解决依赖于表观遗传在精子发生过程中的调节作用及其协同关系的进一步研究与认识，从而有助于深入阐明男性不育的发生机制，为针对不同的发病机制提出合理的治疗方案奠定基础。

［1］Zamudio NM，Chong S，O’Bryan MK．Epigenetic regulation in male germ cells［J］．Reproduction，2008，136(2)：131-146．

［2］O’Bryan MK，de Kretser D．Mouse models for genes involved in impaired spermatogenesis ［J］．Int J Androl，2006，29(1)：76-89．

［3］Miyamoto T，Hasuike S，Yogev L，et al．Azoospermia in patients heterozygous for a mutation in SYCP3 ［J］．Lancet，2003，362(9397)：1714-1719．

［4］Lachner M，Jenuwein T．The many faces of histone lysine methylation ［J］．Curr Opin Cell Biol，2002，14(3)：286-298．

［5］Fuks F．DNA methylation and histone modifications：teaming up to silence genes［J］．Curr Opin Genet Dev，2005，15(5)：490-495．

［6］Oliva R．Protamines and male infertility ［J］．Hum Reprod Update，2006，12(4)：417-435．

［7］Berger SL．Histone modifications in transcriptional regulation［J］．Curr Opin Genet Dev，2002，12(2)：142-148．

［8］Glaser S，Lubitz S，Loveland KL，et al．The histone 3 lysine 4 methyltransferase，M112，is only required briefly in development and spermatogenesis ［J］．Epigenetics Chromatin，2009，2(1)：5．

［9］Payne C，Braun RE．Histone lysine trimethylation exhibits a distinct perinuclear distribution in Plzf-expressing spermatogonia ［J］．Dev Biol，2006，293(2)：461-472．

［10］Lachner M，O’Carroll D，Rea S，et al．Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins ［J］．Nature，2001，410(6824)：116-120．

［11］Peters AH，O’Carroll D，Scherthan H，et al．Loss of the Suv39h histone methytransferases impairs mammalian heterochromatin and genome stability ［J］．Cell，2001，107(3)：323-337．

［12］Tachibana M，Nozaki M，Takeda N，et al．Functional dynamics of H3K9 methylation during meiotic prophase progression ［J］．EMBO J，2007，26(14)：3346-3359．

［13］Katz DJ，Edwards TM，Reinke V，et al．A C．Elegans LSD1 demethylase contributes to germline immortality by reprogramming epigenetic memory ［J］．Cell，2009，137(2)：308-320．

［14］Okada Y，Scott G，Ray MK，et al．Histone demethylase JHDM2A is critical for Tnp1 and Prml transcription and spermatogenesis［J］．Nature，2007，450(7166)：119-123．

［15］ Hammoud SS，Nix DA，Hammoud AO，et al．Genome-wide analysis identifies changes in histone retention and epigenetic modifications at developmental and imprinted gene loci in the sperm of infertile men ［J］．Hum Reprod，2011，26(9)：2558-2569．

［16］Steilmann C，Cavalcanti MC，Bartkuhn M，et al．The interaction of modified histones with the bromodomain testis-specific(BRDT)gene and its mRNA level in sperm of fertile donors and subfertile men ［J］．Reproduction，2010，140(3)：435-443．

［17］An W．Histone acetylation and methylation：combinatorial players for transcriptional regulation ［J］．Subcell Biochem，2007，41：351-369．

［18］Nair M，Nagamori I，Sun P，et al．Nuclear regulator Pygo2 controls spermiogenesis and histone H3 acetylation ［J］．Dev Biol，2008，320(2)：446-455．

［19］Hazzouri M，Pivot-Pajot C，Faure AK，et al．Regulated hyperacetylaton of core histones during mouse spermatogenesis：involvement of histone deacetylases ［J］．Eur J Cell Biol，2000，79(12)：950-960．

［20］McGraw S，Morin G，Vigneault C，et al．Investigation of MYST4 histone acetyltransferase and its involvement in mammalian gametogenesis［J］．BMC Dev Biol，2007，7：123．

［21］Fenic I，Hossain HM，Sonnack V，et al．In vivoapplication of histone deacetylase inhibitor trichostatin-a impairs murine male meiosis ［J］．J Androl，2008，29(2)：172-185．

［22］Sonnack V，Failing K，Bergmann M，et al．Expression of hyperacetylated histone H4 during normal and impaired human spermatogenesis ［J］．Andrologia，2002，34(6)：384-390．

［23］Hoyer-Fender S．Molecular aspects of XY body formation ［J］．Cytogenet Genome Res，2003，103(3-4)：245-255．

［24］Baarends WM，Wassenaar E，van der Laan R，et al．Silencing of unpaired chromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis ［J］．Mol Cell Biol，2005，25(3)：1041-1053．

［25］Osley MA．Regulation of histone H2A and H2B ubiquitylation［J］．Brief Funct Genomic Proteomic，2006，5(3)：179-189．

［26］Lu LY，Wu J，Ye L，et al．RNF8-dependent histone modifications regulate nucleosome removal during spermatogenesis［J］．Dev Cell，2010，18(3)：371-384．

［27］Govin J，Caron C，Lestrat C，et al．The role of histones in chromatin remodeling during mammalian spermiogenesis ［J］．Eur J Biochem，2004，271(17)：3459-3469．

［28］Papoutsopoulou S，Nikolakaki E，Chalepakis G，et al．SR protein-specific kinase 1 is highly expressed in testis and phosphorylates protamine 1 ［J］．Nucleic Acids Res，1999，27(14)：2972-2980．

［29］Balhorn R，Corzett M，Mazrimas JA．Formation of intraprotamine disulfidesin vitro［J］．Arch Biochem Biophys，1992，296(2)：384-393．

［30］Cho C，Jung-Ha H，Willis WD，et al．Protamine 2 deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice［J］．Biol Reprod，2003，69(1)：211-217．

［31］Aoki VW，Liu L，Carrell DT．Identification and evaluation of a novel sperm protamine abnormality in a population of infertile males ［J］．Hum Reprod，2005，20(5)：1298-1306．

［32］de Yebra L，Ballescà JL，Vanrell JA，et al．Complete selective absence of protamine P2 in humans［J］．J Biol Chem，1993，268(14)：10553-10557．

［33］Carrell DT，Emery BR，Hammoud S．The aetiology of sperm protamine abnormalities and their potential impact on the sperm epigenome ［J］．Int J Androl，2008，31(6)：537-545．

［34］Hammoud SS，Purwar J，Pflueger C，et al．Alterations in sperm DNA methylation patterns at imprinted loci in two classes of infertility ［J］．Fertil Steril，2010，94(5)：1728-1733．

Histone Modifications during Spermatogenesis and Male Infertility

PAN Xiao-yan1，LI Zhi-xin1，WANG Zheng-chao2，WANG Xue-nan3，HUANG Bing-yang1，DOU Zhao-hua1，SUN Yan-mei4

1Department of Histology and Embryology，Jilin Medical College，Jilin，Jilin 132013，China
2Provincial Key Laboratory for Developmental Biology and Neuroscience，College of Life Science，
Fujian Normal University，Fuzhou 350007，China
3Reproductive Medicine Center，the Affiliated Hospital of Jining Medical College，Jining，Shandong 272029，China4Department of Inspection，Jilin Medical College，Jilin，Jilin 132013，China

SUN Yan-meiTel：0432-64560019，E-mail：pxy19790105@163．com

Many pathological phenomena of male infertility are related to epigenetic changes in male germ cells．Epigenetic regulation during spermatogenesis plays an important role in mitotic/meiotic divisions and spermiogenesis．The histones have various post-translational modifications on different amino acid residues duringspermatogenesis．These modifications are crucial to the precise regulation of spermatogenesis．Moreover，the histone-to-protamine transition will occur during spermiogenesis．Many studies have also found that abnormal changes of histone modifications during spermatogenesis may damage the sperm development，leading to male sterility．This article reviews the changes of histone modifications during spermatogenesis，the regulation of the development of male germ cells，and the relationship between histone abnormalities and male sterility．

spermatogenesis;histone modifications;protamine;male sterility

孙艳美 电话：0432-64560019，电子邮件：pxy19790105@163．com

R321．1

A

1000-503X(2014)01-0108-06

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．020

吉林省中医药管理局中医药科技项目 (2012-165)、吉林省科技发展计划项目 (201201077、20140204033YY)、吉林市科技发展计划资助项目 (2013625023)、山东省高等学校科技计划项目 (J13LL04)和吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目［吉教科合字 (2014)第366号］Supported by the Traditional Chinese Medicine Scientific and Technological Project of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province(2012-165)，the Scientific and Technological Research Project of Jilin Province(201201077，20140204033YY)，the Scientific and Technological Development Plan Project of Jilin City(2013625023)，the Science and Technology Plan Project of Colleges and Universities in Shandong Province(J13LL04)，and the“Twelfth Five-Year”Scientific and Technological Research Project of Education Department of Jilin Province［吉教科合字 (2014)第366号］

2013-05-28)