尼龙膜套管分离技术对混合斑中精子细胞DNA的提取

马 骏 ，童 奇 ，高良弼 ，朱 川 ，江志强

（1.长兴县公安司法鉴定中心，浙江 长兴 313100；2.安吉县公安司法鉴定中心，浙江 安吉 313300）

法医DNA分析技术在刑事司法实践中的作用日益凸显。大多数性侵案件中，常常遇到混合斑的DNA检验，如何从女性阴道分泌液与男性精液组成的混合斑中获得精子细胞是检验鉴定的关键，而精子的个体来源鉴定又是案件侦破和诉讼的关键。一般此类混合斑的检材载体类型较多，采用常规的差异裂解法[1]对精子细胞进行分离，实验时间长，步骤繁琐，特别是在女性阴道上皮细胞大量存在而精子细胞较少时，很难获得完整、单一的精子细胞DNA分型，有时即使获得了分型结果，也多为混合分型[2]。而在实践中面对大量检材时，常要求在短时间内进行精子细胞的提取，但存在消耗时长和提取效率之间的不平衡。基于此，笔者运用尼龙膜套管分离技术，建立一种新型的混合斑中精子细胞分离的方法，以有效解决上述难题。

1 材料与方法

1.1 材料

40份男女性混合斑检材来源于长兴县公安局所承办的性侵案件，其中阴道拭子26份、内裤8份、床单3份、卫生纸2份、卫生棉1份。

1.2 主要试剂和仪器

人精液PSA检测金标试剂条（德国MERCK公司），硅膜试剂盒（Forensic DNA Extraction Kit for Soft Tissues，加拿大 Pulse 公司），AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒（美国AB公司）。

尼龙膜套管（加拿大Pulse公司），9700型PCR仪、3500xL基因分析仪（美国AB公司），5355型恒温混匀仪（德国Eppendorf公司）。

1.3 精子细胞分离方法

依据GA 766—2008人精液PSA检测金标试剂条法[3]对40份检材（1～40号）进行检验，结果均呈阳性，其中21、29号（阴道外口拭子）和36号（现场床单）检材为弱阳性。对所有样本分别采用常规差异裂解法和尼龙膜套管分离技术对精子细胞进行分离。

1.3.1 常规差异裂解法

通过多波段光源照射，剪取40份检材上可疑斑迹适量（约0.5cm×0.5cm），置于1.5mL离心管中，剪碎，加入 TNE 缓冲液 900 μL、10%SDS 裂解液 100 μL、10mg/mL蛋白酶K 7μL，37℃下置于5355型恒温混匀仪上混匀4h。

将1.5mL离心管漩涡振荡1min。采用套管离心法（离心半径 7cm，5000r/min，离心 15 min），用 1 mL TNE缓冲液浸润后，以离心半径7cm，5 000 r/min，离心10min，弃去上清液。外部1.5mL离心管得沉淀精子及女性DNA残留物，加入1 mL TNE缓冲液重新悬浮，以离心半径7cm，13000r/min，离心5min，重复3次后弃去上清液，得到精子细胞沉淀约50μL。

1.3.2 尼龙膜套管分离技术

通过多波段光源照射，剪取40份检材上可疑斑迹适量（约0.4 cm×0.4 cm），置于2 mL离心管中，剪碎，加入 TNE缓冲液 1.35 mL、10%SDS裂解液 150 μL、10 mg/mL蛋白酶K 12 μL，56℃下置于 5355型恒温混匀仪上混匀4h。

将2mL离心管漩涡振荡1min，以离心半径7cm，2500r/min，离心2min[4]，分批次吸取上清液加入尼龙膜内套管中，10 000×g离心1 min，期间更换外套管。用600μL TNE缓冲液清洗离心管内检材1次，漩涡振荡1min，以离心半径 7cm，2500r/min，离心 2min，吸取上清液至前述尼龙膜内套管中，10 000×g离心1min。用600μL TNE缓冲液清洗内套管分离的精子细胞3次，10000×g离心1min，内套管尼龙膜上得分离精子细胞。

为验证精子细胞是否完全被尼龙膜截获，分别收集最后的清洗液，10000×g离心5min，得沉淀约50μL，按照精子细胞DNA提取方法提取，检验是否有精子细胞被清洗滤过尼龙膜。

1.4 精子细胞DNA的提取、PCR扩增与分型检测

将分离所得的精子细胞使用硅膜试剂盒进行提取。

经过两种方法提取的精子细胞DNA模板采用AmpFℓSTR®Identifiler®Plus PCR扩增试剂盒在9700型PCR仪上进行复合扩增，扩增体系为10μL，扩增产物使用3500xL基因分析仪进行电泳分离和激光扫描分析，采用GeneMapperTMID-X v1.4软件分析获得检材的STR分型结果。

2 结 果

40份混合斑检材采用两种提取方法的分型结果见表1。采用尼龙膜套管分离技术分离的检材仅3份有女性成分微弱残留，其余均获得了完整的单一男性精子细胞STR分型，峰值均在4000～30000RFU，均衡性较好。采用常规差异裂解法分离的检材中，有25份完全未检出男性精子细胞STR分型，15份检出男性精子细胞STR分型（7份为不完整的男性精子细胞STR分型，6份有女性成分残留，2份为完整的单一男性精子细胞STR分型）。

尼龙膜套管最后的清洗液沉淀中未检出男性精子细胞，说明在高速离心清洗时无精子细胞透过尼龙膜，精子细胞无明显损失。

表1 40份混合斑检材采用两种提取方法的分型结果 （N=40）

3 讨 论

性侵案件中混合斑检材的载体类型较为复杂，一般情况下，阴道拭子、内裤较多。常规差异裂解法对精子细胞进行分离，往往都在体积较小的1.5 mL离心管中[5]，振荡分离时空间有限，不利于精子细胞与载体的分离。因此，混合斑中的精子细胞DNA能否检验成功，关键在于能否实现精子细胞与载体的分离[6]。

尼龙膜套管包括柱状内管和2 mL离心外管，内管直径约8mm、长2.5cm（最多可加入800μL液体），底部为孔径0.45 μm的尼龙膜（经过疏水处理），对DNA低吸附，在无离心力的作用下液体无法渗漏。精子细胞膜富含硫醇蛋白[7]，需在二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巯基乙醇等还原剂的作用下才能打开其中的二硫键，从而破膜释放DNA[8]。精子细胞一般头部长 3.0～5.0μm、宽 2.0～3.0μm，体部长 5.0～7.0μm、宽1.0μm，尾部长40～60μm[9]，根据分子筛原理，当消化后的混合液体流经内管后，未被消化的精子细胞经过滤被拦截在尼龙膜内，女性上皮细胞DNA成分随溶液穿过尼龙膜进入外套管内，从而达到物理分离精子细胞的目的。

本研究在第一步消化时直接采用56℃孵育，能提高蛋白酶K的裂解效率（蛋白酶K在56～65℃时活性较高[10]），精子在硫醇蛋白的保护下不受影响，而女性上皮细胞则能够基本消化干净，运用低速离心分离去除载体，再利用尼龙膜过滤，高速离心收集精子细胞，从而达到物理分离精子细胞的目的。尼龙膜套管具有疏水、低吸附DNA的特性，女性DNA成分几乎不会残留在尼龙膜上，清洗精子细胞时也不会因为操作因素导致精子细胞的损失，使得分离较为彻底。

本研究中有部分阴道中段拭子和棉质内裤的检材通过尼龙膜套管分离技术检出女性成分残留，分析其原因是女性上皮细胞含量较多，增加洗涤次数可以解决该问题。常规差异裂解法中部分载体（如床单、丝质内裤、卫生纸、卫生棉）检出率较低，分析其原因是载体的纤维有较强的吸附力，精子细胞与载体分离不彻底，与尼龙膜套管分离技术相比，常规差异裂解法洗脱能力有限。因此，尼龙膜套管分离技术检出完整的单一男性分型的数量要高于常规差异裂解法，尼龙膜对于精子细胞的分离也较为彻底。

当然，混合斑中精子细胞的分离方法还有很多，如激光捕获显微切割技术、显微操作、流式细胞仪技术、免疫磁珠沉淀等[8]，但是，多数方法对于实验操作者的经验和技术要求较高，基层实验室在相关仪器设备的配备上也有限制，因此，在大量的日常检案中很难发挥作用。

综上所述，本研究建立的尼龙膜套管分离技术适用于混合斑中精子细胞的分离，可以将混合斑中精子细胞和女性细胞的DNA彻底分离，减少精子损失，特别是对含有大量女性细胞且精子细胞较少的检材提取效果明显，整个提取实验成本低廉、快速简便，无需特殊设备，在日常检案中具有较高的应用价值。