鱼精蛋白制备与功能研究进展

朱 淞，高莉莉，吕 泉，蒋 丹，张 荣

（1. 大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023；2. 鲅鱼圈海关综合技术服务中心，辽宁营口 115020；3. 中国农业科学院 农产品加工研究所，北京 100093）

鱼精蛋白（Protamine） 是一种碱性蛋白质，存在于鱼类的成熟精巢组织（鱼白） 中，通常由大约30 个氨基酸组成，以精氨酸为主，分子量大多小于10 000 Da，等电点为10～12[1]。

鱼精蛋白组成较为特殊，高比例的碱性蛋白序列赋予其不同于其他蛋白质的独特功能，具有广谱、高效、安全的杀菌活性，是绿色、天然的食品防腐剂。基于良好的结合肝素的能力，鱼精蛋白硫酸盐成为体外循环心脏手术中唯一对抗肝素的药物，在临床上广泛用于抗凝血剂的解毒剂[2-3]。鱼精蛋白还具有抗疲劳、助呼吸、促消化、降血压、抑制肿瘤生长等重要生理功能[4]。目前，鱼精蛋白的作用机理尚不明确，限制了鱼精蛋白的进一步应用；由于精深加工技术的不成熟，鱼精蛋白在水产加工企业未得到充分的开发利用。

主要对鱼精蛋白制备技术及结构与功能的研究进展进行综述，以期为鱼精蛋白的后续研究与开发利用提供参考。

1 鱼精蛋白的分类

按碱性氨基酸组成分类，鱼精蛋白可分为3 类：①单鱼精蛋白，碱性氨基酸只有精氨酸；②双鱼精蛋白，碱性氨基酸含有精氨酸和组氨酸与赖氨酸其中的1 种；③三鱼精蛋白，含有精氨酸、组氨酸和赖氨酸3 种碱性氨基酸[5]。

大多数鱼精蛋白不是单一组成，而是由多种性质相近的蛋白共同组成的混合物，不同鱼种的鱼精蛋白的碱性氨基酸占比不同。

不同鱼精蛋白的碱性氨基酸占比见表1。

表1 不同鱼精蛋白的碱性氨基酸占比

由表1 可知，金枪鱼、鲢鱼、鲤鱼、鱿鱼及大马哈鱼为三鱼精蛋白；鲀鱼精蛋白为双鱼精蛋白；鲱鱼、乌鱼、鲑鱼精蛋白为单鱼精蛋白，其中精氨酸为主要碱性氨基酸，乌鱼精蛋白精氨酸含量最高，达到了88.39%。

2 鱼精蛋白的制备与检测

2.1 鱼精蛋白的制备

1870 年，瑞士科学家首次从莱茵河鲑鱼精巢中得到一种含氯化合物，将其命名为“鱼精蛋白”。之后，德国、前苏联、美国科学家分别从不同鱼种中提取出鱼精蛋白。早期主要采用硫酸或盐酸提取，大量有机溶剂洗涤沉淀的方法提取鱼精蛋白。其中，硫酸提取法以其操作简便、成本较低的优点成为了鱼精蛋白粗提取的主要方法[8]。张家源[11]采用硫酸提取，冷乙醇沉淀的方法从鲀鱼鱼白中成功提取出鱼精蛋白，并验证其具有良好的抑菌活性。钟立人、曹文红等人[13-14]也采用硫酸提取结合试剂沉淀的方法，分别从鲤鱼、中巨石斑鱼鱼白中提取出具有活性的鱼精蛋白。

工业化生产中为了进一步降低生产的成本，扩大生产规模，通常采用超声辅助、生物酶辅助、吸附剂及膜萃取的方式提取鱼精蛋白，经加工的鱼精蛋白可应用于科研、食品、医药等诸多领域[15-18]。

2.2 鱼精蛋白的纯化与鉴定

经酸提法初步提取出的鱼精蛋白通常含有其他杂蛋白，若要得到纯度较高的鱼精蛋白还需进一步纯化。粗鱼精蛋白的纯化通常采用葡萄糖凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography，GFC）、离子交换层析（Ion-exchange chromatography, IEC） 及等电点沉淀等方法（见表2）。纯化后可采用反相高效液相色谱（Reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE） 及LC-MS 的方法进行鱼精蛋白的定性鉴定[19-20]。

表2 鱼精蛋白的纯化方法

上官新晨[8]通过等电点沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析三步法纯化鲤鱼精蛋白，经高效液相色谱以及凝胶电泳鉴定显示单一峰和单一条带，得到了纯度较高的鲤鱼精蛋白。最新的研究显示，鱿鱼[9]、鲀鱼[11]等鱼的精蛋白经凝胶过滤层析、离子交换层析的方法纯化后，仍存在多种不同分子量的组分，表明鱼精蛋白的非单一蛋白的特性。

鱼精蛋白的纯化方法见表2。

2.3 鱼精蛋白的定量检测

鱼精蛋白作为肝素的拮抗剂已被广泛应用于临床，对血液中的肝素和鱼精蛋白需要精准快速定量，才能准确应用于临床医疗中，规避可能存在的风险。目前，鱼精蛋白检测的主要方法有高效液相色谱法、常规比色法、传统荧光法和电化学分析等方法，然而这些方法具有一些缺点，如复杂的仪器和繁琐的程序，液相色谱法目前普遍用于定性检测，传统荧光法虽然灵敏，但难以避免干扰物质[22-23]。表3 为鱼精蛋白最新定量检测方法，新型荧光法在鱼精蛋白的检测中具有操作简便、高灵敏度等优势，成为了研究的热点。

表3 鱼精蛋白的检测方法

鱼精蛋白的检测方法见表3。

3 鱼精蛋白的结构与功能

3.1 结构

不同来源的鱼精蛋白一级结构具有一定的相似性，如N 端富含亲水的氨基酸残基、精氨酸、赖氨酸等，C 端大多具有疏水性残基；鱼精蛋白均含有多个精氨酸簇，且被特定的氨基酸残基（如Ser，Thr，Gly-Gly 等） 分隔开。有研究者对于鱼精蛋白的抑菌机理进行研究，得出精氨酸可产生静电作用，破坏细菌的细胞壁结构[34]。目前，普遍认为是精氨酸与细菌细胞壁上的肽聚糖产生静电作用，从而抑制细菌生长[35]。精氨酸的含量与鱼精蛋白的抑菌效果是否存在对应关系，还有待进一步探究。另有研究显示，通过修饰鱼精蛋白的氨基酸残基侧链，可增强鱼精蛋白的抑菌能力[36]，说明鱼精蛋白的抑菌活性和一级结构密切相关，未来可通过改变鱼精蛋白的序列来增强其生物活性。

鱼精蛋白也可以称作抗菌肽，以二级结构分类，天然抗菌肽可分为α - 螺旋肽、β - 折叠肽、线性延伸肽和环状肽[37]。Roque A 等人[38]研究了鲑精蛋白及鱿鱼精蛋白的结构，二者具有相似数量的β - 转角，但α - 螺旋和非氢键结构比例差异巨大。皮杜鹃[39]则首次研究了鱼精蛋白二级结构和抑菌活性的关系，认为随着β - 转角含量降低，抑菌活性也相对降低。已有的研究存在许多明显的不足之处，结构的研究不够深入广泛，并未阐明高级结构的变化与功能之间的关系，结构与抗凝血活性的关系也有待阐明。解析鱼精蛋白的结构对于了解鱼精蛋白的作用机理至关重要，能够为鱼精蛋白的生物合成及修饰提供方向。

3.2 鱼精蛋白在食品领域的应用

1931 年，Uyttendaele M等人[40]首次报道了鱼精蛋白的抑菌活性，因其来源于食物，具有纯天然、无毒性的特点，成为绿色食品防腐剂的首选。鱼精蛋白的抑菌机理主要有3 种观点：①破坏菌体细胞壁或细胞膜结构；②作用于细胞内部的核酸和蛋白质；③抑制菌体内能量相关酶的活性[41]。

20 世纪，日本就将鱼精蛋白作为防腐剂用于饭团、乳油等食品中[12]。李兆龙[42]报道，将牛奶、鸡蛋等食品中添加0.5%～1.0%鱼精蛋白可将保质期提升至5～6 d，满足人们对天然无化学添加的高品质的需求。

鱼精蛋白也可与其他防腐剂结合使用，减少化学防腐剂的使用量，降低潜在食品安全隐患。王陆玲等人[43]用鱼精蛋白与山梨酸钾复配，结果表明二者复配优于单独使用，且在1%的质量分数下即具有良好防腐功能。鱼精蛋白可以与醋酸、甘氨酸、苯甲酸钠等化学防腐剂复配[12]，也可以与其他天然防腐剂，如迷迭香、香芹酚等复配，均能够延长食品的保质期[44-46]。

最新研究显示，具有抗氧化、抗疲劳活性的鱼精蛋白肽均已成功制备，其应用于功能食品的潜力巨大[47-50]。

鱼精蛋白应用于食品领域仍存在诸多问题，如产量不足、成本过高等。目前，通过基因工程表达和人工合成具有活性的鱼精蛋白已有文章报道，从传统的提取纯化加工转化为基因工程生产可显著降低成本，仍需进一步研究[51]。

3.3 医学中的功能

鱼精蛋白在医学领域的应用更为深入。①肝素拮抗功能。鱼精蛋白硫酸盐是体外循环心脏手术中唯一对抗肝素的药物，可作抗凝血剂的解毒剂[52]。其作用机理是鱼精蛋白可与肝素形成复合物，使肝素失活[53]。鱼精蛋白也可能引起不良反应，最新的研究表明，不同给药剂量和给药方式，可能避免此类风险。使用肾上腺素、多巴胺等，治疗不良反应的出现[54-57]。②缓释胰岛素功能。鱼精蛋白能够与多和胰岛素结合，阻止或延迟胰岛素释放，进而延长胰岛素的作用时间，且未见明显不良反应，具有低风险的特性。目前，鱼精蛋白重组胰岛素已被应用于临床治疗[58]。③抗肿瘤功能。研究证明，鱼精蛋白可抑制肿瘤细胞分泌出的肿瘤蛋白，进而抑制结直肠癌细胞分裂增殖，具有临床抗癌的效果。④调节免疫功能。研究发现，鱼精蛋白能够诱导体液免疫，增强小鼠对大肠杆菌的抵抗力，可作为大肠杆菌疫苗的候选佐剂，具备高度潜在的医学应用价值，可进一步研究鱼精蛋白的促进免疫特性，为后续鱼精蛋白应用于疫苗生产打下基础。除此之外，鱼精蛋白还可以治疗男性不孕不育，以及作为非病毒载体应用于医学领域。

4 结语

鱼精蛋白具有多种独特的生物功能，有待充分的研究，实现鱼白的精深加工和利用，未来研究将聚焦于以下几个方面。①优化鱼精蛋白的提取纯化方法，降低成本，从而获得高纯度的蛋白，成为安全的医学材料；②通过质谱技术、X射线衍射技术和生物信息学分析、功能评价等，对于鱼精蛋白的结构和功能进行深入的探讨，以明确鱼精蛋白的功能机理；③探究鱼精蛋白与更多防腐剂的复配保鲜作用，更好地发挥其绿色防腐功效；④采用基因工程的手段生产和改造鱼精蛋白，实现从天然提取到生物制造、生物改造等现代加工方式。

随着研究的不断深入，鱼精蛋白将成为水产品产业链上的重要一环，被更广泛地应用于食品、医学等更多领域中，为人类作出更多贡献。