富硒大豆多肽对高脂致大鼠脂肪肝和抗氧化功能的影响*

王凤杰，陈显兵，张书毓，谭志鑫，向国敏，刘锦红

流行病学调查显示随着人们生活水平的提高，脂肪肝的发病率逐年上升，近年研究表明，脂肪肝患者体内活性氧聚集，而且肝组织氧化应激反应增强会严重危害机体的肝功能［1］。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是位于内质网上的一种分子伴侣蛋白，在氧化应激时大量表达以维持内质网的稳定，被看作是内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的标志性蛋白［2］，有研究显示ERS信号通路及其效应与非酒精性脂肪肝病关系密切［3］。因此本实验从营养干预角度研究富硒大豆多肽对脂肪肝大鼠肝组织酶活性及自由基代谢的影响及可能机制，为临床疾病的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 药物、主要试剂和仪器

富硒大豆多肽粉由实验室自制［4］，其中测出硒含量 13.031mg／kg。胆固醇（武汉化学试剂公司）；猪油、鸡蛋自备。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；离心机（德国eppendorf 5418型）；UV-5300紫外可见分光光度计和冰冻切片机（德国徕卡1850uv）；兔抗大鼠GRP78（美国Bioword公司）；辣根酶标记山羊抗兔（中杉金桥）。

1.2 实验动物及分组

Wistar大鼠40只，由湖北省实验动物中心提供，雌雄各半，体重150～180 g，常规喂养1周后分为4组：（n＝10），正常对照组（NC）喂标准饲料（由湖北民族学院动物房提供）、灌喂同体积的生理盐水；高脂模型组（HC）喂高脂饲料（在标准饲料中添加胆固醇2%、猪油10%和鸡蛋5%）、灌喂同体积的生理盐水；高硒组（SeN）喂标准饲料及富硒大豆多肽水溶液（100mg／kg bw）；富硒大豆多肽组（SeH）喂高脂饲料，富硒大豆多肽水溶液（100mg／kg bw）。按上述要求持续喂养10周。

1.3 观察指标及测定分析方法

1.3.1 一般情况变化 处死前禁食24 h，下腔静脉采血及分离取出肝脏标本备用，并计算体重、肝重及肝指数（肝脏湿重／体重），分析各指标变化。

1.3.2 肝脏组织病理学检查 肝脏分别取材：（1）10%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色观察肝脏脂肪变性、炎细胞浸润及纤维化程度。（2）苏丹Ⅲ染色：肝组织冰冻切片，片厚6μm，70%酒精固定2min，放入苏丹Ⅲ酒精溶液中染色25 min，70%酒精洗去多余的染料、水洗，苏木素复染3 min，1%盐酸酒精分化、水洗，蓝化，甘油封固。脂肪呈橘黄色或者红色。光镜下评估脂肪变性程度［5］。（3）免疫组织化学染色：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化法（SP）法，DAB显色，一抗GRP78的工作浓度为 1：100，操作流程按试剂说明书进行。GRP78表达程度判断标准：＋：肝小叶内约有1／3以下细胞阳性染色，着色为浅黄色；＋＋：肝小叶内约有2／3细胞阳性染色，着色为棕黄色或棕色；＋＋＋：肝小叶内约有2／3以上细胞阳性染色，着色为棕褐色或深棕色［6］。

1.3.3 血清和肝匀浆GSH-Px、MDA和 SOD测定（1）取血测定血清中 GSH-Px、MDA和 SOD含量；（2）取-80℃冻存肝组织约1 g，在冰浴中用EDTA-PBS缓冲液（PH 7.4）制成 10%的匀浆，离心，取上清测GSH-Px、MDA和SOD含量。测定方法均按试剂盒说明书操作，GSH-Px、MDA和SOD测定分别采用二硫代二硝基苯甲酸法（DTNB法）、硫代巴比妥酸法（TBA法）和亚硝酸盐法。

1.3.4 血脂和肝功能检测 用全自动生化分析仪检测大鼠血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三脂（triglycerides，TG）的水平。

1.4 统计学处理

所有数据以均数±标准差（¯x±s）表示，统计处理采用SPSS 17.0进行分析，结果用单因素方差分析和 t检验进行分析处理。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、肝重及肝指数的变化

HC组大鼠体重、肝重及肝指数均明显高于NC组，富硒大豆多肽干预后各指数均降低（P＜0.05）。NC与 SeN组各指标无明显差异（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Changes of body weight，liver weight and liver index of the four groups（¯x±s，n＝10）

2.2 肝脏组织病理学变化

常规HE染色证实NC及SeN两组大鼠肝脏无明显肝细胞脂肪变性；HC组见肝小叶内多数肝细胞胞浆疏松呈空泡状，小叶中央区可见肝细胞水肿，部分区可见散在点灶状坏死及炎细胞浸润，但无明显纤维组织增生，说明高脂模型组大鼠肝脏出现明显脂肪变性；SeH组肝细胞内空泡数量明显减少，炎细胞浸润程度改善。

苏丹Ⅲ染色，NC及SeN两组大鼠肝细胞浆内无明显红色脂滴；HC组见弥漫性红色脂滴，大部分肝细胞内挤满了红色的微小脂滴；SeH组肝内脂滴数量明显减少（图1见彩图页Ⅱ）。随机选取五个高倍视野计数每100个肝细胞内的脂滴阳性细胞数，统计结果见图2，显示高脂组肝脏内明显脂肪变性，干预后脂肪肝病变程度减轻。

2.3 肝脏GRP78表达情况

GRP78表达定位于肝细胞胞浆，NC及SeN组的表达不明显，散在分布，无明显差异；HC组内可见GRP78表达呈弥漫性分布，分布范围与肝细胞脂肪变性的分布范围较一致，SeH组大鼠肝内GRP78表达较HC组明显减弱（图3见彩图页Ⅱ）。随机选取五个高倍视野计数每100个肝细胞中GRP78表达细胞数，统计结果见图4。

Fig.2 Number of positive cells（¯x±s，n＝10）NC：Normal group；HC：Model group；SeN：Control group；SeH：Experimental group**P＜0.01 vs NC；＃P＜0.05 vs HC

Fig.4 Number of GRP78 positive in 100 cells（¯x±s，n＝10）NC：Normal group；HC：Model group；SeN：Control group；SeH：Experimental group**P＜0.01 vs NC；＃＃P＜0.01 vs HC

2.4 大鼠血清和肝匀浆中GSH-Px、SOD和MDA的变化

2.4.1 血清中各指标变化 HC组血清中SOD和GSH-Px活性均较NC组明显降低，MDA含量增高，而模型组灌喂富硒大豆多肽后，SOD、GSH-Px活性提高，差异有统计学意义（P＜0.05），证实富硒干预后大鼠血中抗氧化酶活性增高，但MDA含量仍高于NC组，可能是大鼠血液内脂质过氧化反应指标仍高于正常。SeN与NC组相比无明显差异（表2）。

2.4.2 肝匀浆中各指标变化 HC组大鼠肝匀浆组织中SOD和GSH-Px活性均较NC组明显降低，MDA含量增高，而且干预后SOD、GSH-Px活性提高，MDA含量下降，差异有显著统计学意义，说明富硒干预后肝脏脂质过氧化反应明显减轻（P＜0.01，表3）。

Tab.2 Level of GSH-Px、SOD and MDA in serum of rats（¯x±s，n＝10）

Tab.3 Level of GSH-Px、SOD and MDA in liver of rats（¯x±s，n＝10）

2.5 各组大鼠血脂和肝功能变化

HC组血清中 ALT、AST、TC及 TG均明显高于NC和SeN组，干预后SeH组各指标均下降，差异有统计学意义，证明富硒大豆多肽干预后肝功能及血脂水平均得到明显改善（表4）。

Tab.4 Changes of liver function and blood lipid of four groups（¯x±s，n＝10）

3 讨论

有研究证实脂肪肝的发病机制与脂质过氧化和氧化应激密切相关［7］，而高脂饲料可诱导大鼠肝脏细胞的氧化应激状态［8］，高糖高脂膳食喂养后大鼠血中甘油三酯、胆固醇及低密度脂蛋白的浓度均明显增加［9］，因此本实验选用高脂饮食诱导大鼠脂肪肝模型，结果显示脂肪肝组大鼠肝重及肝指数均明显高于正常组，血脂（TC，TG）及血清 ALT，AST均较正常组增高，另外病理组织学显示脂肪肝组大鼠肝脏脂肪变性明显，小叶内灶性炎细胞浸润，证明造模成功。高脂模型组大鼠血清及肝匀浆内SOD，GSHPx含量均低于正常组，MDA含量显著高于正常组，说明肝内抗氧化反应酶活性降低，同时脂质过氧化反应增强，提示氧应激和脂质过氧化反应可能参与脂肪肝的发生。

细胞内氧化应激可以破坏内质网稳态和诱导内质网应激（ERS），内质网是脂肪酸代谢的第一场所，同时发现脂肪酸在内质网代谢会产生一定量的活性氧（ROS），氧化应激能启动钙从内质网钙池的释放，导致线粒体内钙积聚，这进一步增加了活性氧的产生，放大氧化应激及钙负载，引起恶性循环。GRP78是ERS的标志性蛋白，其表达增加能维持内质网的稳定［10］，引导蛋白质正确折叠，改善细胞生理状态，起到暂时保护细胞、延缓炎细胞浸润等作用［11］，我们实验中发现高脂饮食引起的NAFLD肝脏GRP78表达增加，提示高脂饮食诱导了肝ERS。富硒大豆多肽干预可以提高大鼠血清及肝匀浆中GSH-Px、SOD活性和降低MDA含量，尤其是降低肝组织内的MDA含量作用更加明显，从而纠正体内氧化抗氧化失衡状态，改善肝脏脂肪变性和炎细胞浸润程度，降低了肝内GRP78表达，减轻由氧化应激引起的内质网应激，对脂肪肝的发展有一定的干预作用。

田金可等报道硒具有抗氧化功能［12］，程天德证实富硒大豆低聚肽的抗氧化能力比亚硒酸钠强［13］，研究证实微量元素硒通过GSH-Px表现其生物学功能，且硒能直接或和SOD一起清除氧自由基，使动物TC、TG显著降低，升高HDL-C。陈美珍等研究了大豆酶解产物、大豆多肽、大豆低聚肽的抗氧化活性［14］，因此大豆多肽本身含有多种抗氧化的活性肽，具有降低血清LDL胆固醇、促进脂肪代谢、有效清除自由基［15］等作用，富硒大豆多肽干预可提高肝组织内抗氧化酶活性，清除自由基，可能与硒的作用有关，也可能与大豆多肽本身的抗氧化作用密切相关。

本研究证实富硒大豆多肽能增强大鼠脂肪肝的肝脏抗氧化能力，干预脂肪肝的发生发展，其作用机制可能与提高体内抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化反应，降低肝脏内GRP78的表达有关。有关脂肪肝发生过程中富硒大豆多肽是通过哪种途径来减轻肝损伤和提高抗氧化作用的问题，有待于我们进一步研究。

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