低氧调节大鼠前额叶皮层IGFs家族基因的表达*

祖胡月，瞿 专，任纪龙，陈学群，杜继曾

（浙江大学基础医学系神经生物学和生理学研究室，杭州310058）

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）是重要的神经营养因子，具有神经保护作用，在体内广泛分布，通过自分泌、旁分泌和内分泌的方式起作用。IGF的生物学活性受到其结合蛋白IGFBPs的调节，IGFBPs对游离的IGF的含量及IGF与细胞表面IGFR的结合存在精细调节，从而调节靶细胞对IGF信号的应答。其家族包括配体IGF-I，IGF-II，I型、II型胰岛素样生长因子受体，以及6个胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP1-6）。我们的研究表明低氧调节肝脏IGFI和IGFBP1基因表达，高原动物肝细胞IGF-I和IGFBP1基因表达表现出对高原低氧损伤的保护作用［1］，但IGF家族是否参与大鼠低氧下大脑皮层细胞的损伤与保护？本研究目的是探讨低氧下IGF家族对大鼠大脑皮层细胞的损伤保护，比较急性和慢性低氧对脑皮层细胞IGF家族基因表达的不同调节。

1 材料与方法

1.1 动物和低氧处理

实验动物：采用健康雄性、清洁级 SD大鼠，体重（180±20）g，购于浙江省医学科学院实验动物中心（SCXK2008-0033）。随机分为对照组和低氧组（n＝6～7）：低氧组分别模拟 5 km（相当于海平面的 10.8%O2）低氧 8 h、24 h、5 d、10 d和15 d，对照组置于杭州海拔高度不予低氧处理。

实验动物在低氧处理后，被迅速断头牺牲，剥取大脑，置于液氮罐中冷冻，后移至-80℃冰箱保存。称取约50 mg前额叶皮层检测。

1.2 样品准备和方法

qPCR样品制备：使用 E.Z.N.A.DNA／RNA／Protein Isolation Kit（OMEGA，R6734-02）共提取前额叶皮层 DNA、RNA、Protein，放入-80℃冰箱备用。采用TransScript TM First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（TransGenBiotech，AT301）试剂盒将 RNA反转录为cDNA，于-20℃冰箱保存。

1.3 Quantitative Real-Time PCR

qPCR反应体系使用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM，利用Roche荧光定量PCR仪-480II进行实验和分析，以18s rRNA作为内参。IGF-I，IGF-II，IGF-1R，IGFBP1和 18S荧光定量引物如下（表1）。经严格预实验，PCR产物的电泳条带清晰，分子量正确，无杂带，溶解曲线好。

Tab.1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.4 统计学处理

数据用GraphPad Prism5软件分析，用均数±标准差（¯x±s）表示，组间采用 t检验进行比较。

2 结果

2.1 急性和慢性低氧5 km对大鼠前额叶皮层IGF-I mRNA表达的调节

急性低氧5 km 8 h显著升高了大鼠前额叶皮层IGF-I mRNA的表达（P＜0.01，图 1），但 24 h时，表达明显降低（P＜0.05，图 1）。慢性低氧第5天时，大鼠前额叶皮层 IGF-I mRNA表达下降（P＜0.05，图1），但第10天和15天时，IGF-I mRNA的表达基本恢复到对照组水平（图1）。

2.2 急性和慢性低氧5 km对大鼠前额叶皮层IGF-II mRNA表达的调节

急性低氧8 h对IGF-II mRNA表达没有明显影响（图2），低氧24 h和5 d下调了 IGF-IImRNA的表达（P＜0.05，图2），但第10天和15天时，IGF-II mRNA的表达基本恢复到对照组水平（图 2）。

Fig.1 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGF-I mRNA expression in rats（¯x±s，n＝6）IGF-I：Insulin-like growth factor I*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Fig.2 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGF-IImRNA expression in rats（¯x±s，n＝6）IGF-II：Insulin-like growth factor II*P＜0.05 vs control

2.3 急性和慢性低氧5 km对大鼠前额叶皮层IGF-1R mRNA表达的调节

急性低氧5 km 8 h时，大鼠前额叶皮层IGF-1R mRNA表达显著升高（P＜0.05，图3）；但低氧24 h时，IGF-1RmRNA的表达显著下降（P＜0.01，图3）。慢性低氧5 d时 IGF-1R mRNA的表达仍维持在低水平（P＜0.05，图 3），10 d时，IGF-1R mRNA的表达量和对照组无明显差异，慢性低氧15 d时其表达显著升高（P＜0.01，图 3）。

Fig.3 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGF-1R mRNA expression in rats（¯x±s，n＝6）IGF-1R：Insulin-like growth factor 1 receptor*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

2.4 急性和慢性低氧5km对大鼠前额叶皮层IGFBP1 mRNA表达的调节

IGFBP1的基因表达在5 km急性低氧8 h时显著升高（P＜0.05，图4），急性低氧24 h和慢性低氧5 d时IGFBP1 mRNA表达均显著降低（P＜0.01，图4）。慢性低氧10 d和15 d时其基因表达恢复到对照组水平（图4）。

Fig.4 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGFBP1 mRNA expression in rats（¯x±s，n＝6）IGFBP1：Insulin-like growth factor binding protein 1*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

3 讨论

急性低氧和慢性低氧均能引起机体神经内分泌网发生适应性的改变［2］。IGFs家族能够保护神经细胞，参与低氧诱导的神经细胞损伤和凋亡。我们的结果显示，急性低氧8 h刺激 IGF-I，IGF-1R，IGFBP1的基因表达 mRNA的表达（除IGF-II），但在24 h的5 km抑制了IGF-I，IGF-1R，IGFBP1以及IGF-II的基因表达。这提示短时急性低氧刺激IGF-I mRNA的表达可能参与低氧神经元损伤的保护过程，但24 h及5 d低氧抑制IGF-I mRNA的表达，这一结果提示较长时间低氧后，神经细胞可能缺乏IGF-I的保护，开始出现损伤，可能是由于IGFBPs与IGF-I的结合导致局部组织处游离的IGF-I含量减少。

慢性连续低氧10 d和15 d，IGF-I，IGF-II和 IGFBP1表达都回复到对照水平。有文献报道缺血缺氧性脑损伤发生后，IGFs家族在脑内的表达增加，但不同成员表达的部位和时间不同。幼年大鼠缺血缺氧脑损伤后，神经元中IGF-I mRNA表达快速下降，与之相伴的是急性期内皮层神经元的损伤。而在2～4 d后损伤部位的IGF-I表达开始增加，在损伤后5 d时达到峰值，之后逐渐回落，在大鼠颈动脉结扎模型中海马区IGF-1R的表达在损伤后6 h开始增加并维持至损伤后4 d。在缺血缺氧性脑损伤中IGF-I与IGF-1R结合，激活下游信号通路，抑制神经元的凋亡，从而起到脑损伤后的神经保护作用；IGFBPs对IGF-I的神经保护作用也起到了重要的调节作用。外源性IGF-I也可能对HIE起到神经保护作用。成年大鼠右侧颈动脉结扎后2 h侧脑室注射IGF-I能够在皮层，纹状体，海马等部位起到神经保护作用［3］。

IGF-I和IGF-II在组织中通常以旁分泌和自分泌的形式发挥作用，IGF-I在幼鼠脑内含量高于成年鼠，CNS发育早期IGF-I能够促进神经元生长，树突分枝形成以及突触发生。CNS发育成熟阶段，IGF-I能调节神经细胞的增殖、分化以及凋亡，还促进神经纤维的修复与再生［4］。有报道称IGF-I调节神经元乙酰胆碱的释放、突触的可塑性、促进增殖和抗凋亡。急性低氧和慢性低氧5 d时都引起IGF-IImRNA的下降，其机制尚不清楚。研究显示IGF-II与IGF-2R有高亲和力，与IGF-1R亲和力较低，但IGF-1R同时也是IGF-II的受体，受体与配体的结合降低了细胞外IGF-II的水平，可能会抑制IGFII的功能。

IGF-1R是一种受体酪氨酸激酶，能激活MAPK和PI3K／Akt两条信号通路。MAPK途径主要参与细胞增殖，PI3K／Akt途径则主要参与IGFs抗凋亡作用。IGF-1R mRNA表达在急性低氧8 h时也显著上升，提示皮层神经元上的IGF-1R能够对IGF-I的刺激做出迅速反应，使IGF-I迅速发挥其生物学效应。在慢性低氧10 d和15 d时，其mRNA表达量仍然维持在较高水平上，这一结果提示IGF-1R可能参与慢性低氧损伤的保护。IGFBP1启动子区第-1090／-1086位上的低氧应答因子（hypoxia response elements，HREs），是应对低氧刺激和低氧诱导因子激活的必要条件，HIF-1能够使IGFBP1的基因表达上调数倍［5］。研究发现低氧促进IGFBP1发生磷酸化，磷酸化的IGFBP1与IGF-I的结合能力远大于IGF-I与IGF-1R的结合能力，因此磷酸化的IGFBP1延长了IGF-I的半衰期。

总之，IGFs家族在应对急性低氧和慢性低氧引起的损伤均起到一定保护作用。IGFs家族参与脑皮层细胞的低氧损伤的保护机制还有待进一步研究，慢性低氧上调的IGF-1R表达和受体信号通路可能是脑皮层细胞的低氧损伤的保护机制之一。

［1］ Chen XQ，Wang SJ，Du JZ，et al.Diversities in hepatic HIF-1，IGF-I／IGFBP-1，LDH／ICD，and their mRNA expressions induced by CoCl2 in Qinghai-Tibetan plateau mammals and sea level mice［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，292（1）：R516-526.

［2］ Chen XQ，Kong FP，Zhao Y，et al.High-altitude hypoxia induces disorder ofthe brain-endocrine-immune network through activation of corticotropin-releasing factor and its type-1 receptors［J］.Chin J Appl Physiol，2012，28（6）：482-487.

［3］ Guan J，Bennet L，Gluckman PD，et al.Insulin-like growth factor-1 and post-ischemic brain injury［J］.Prog Neurobiol，2003，70（6）：443-462.

［4］ Suh HS，Zhao ML，Derico L，et al.Insulin-like growth factor 1 and 2（IGF1，IGF2）expression in human microglia：differential regulation by inflammatory mediators［J］.J Neuroinflammation，2013，10（3）：10-37.

［5］ Kajimura S，Aida K，Duan C.Understanding hypoxia-induced gene expression in early development：in vitro and in vivo analysis of hypoxia-inducible factor 1-regulated zebra fish insulin-like growth factor binding protein 1 gene expression［J］.Mol Cell Biol，2006，26（3）：1142-1155.