大鼠胃纵行和环行平滑肌对细胞外核苷引起的差异收缩反应*

袁文肃，许丽娟，刘梦丹，王悦冰，李 董

胃浆膜下肌层主要包含外层纵形肌（longitudinal muscle，LM）和中层环形肌（circular muscle，CM），胃痉挛是由两种胃壁平滑肌异常收缩引起胃运动功能失调。神经激素控制胃壁平滑肌的收缩，其中非肾上腺能非胆碱能（non-adrenergic non-cholinergic，NANC）神经广泛分布在胃肠道，在胃肠道平滑肌运动的调节中起着重要作用［1］。核苷类物质中 ATP是消化道神经系统的NANC神经递质，对胃肠道动力和分泌功能具有重要的调节作用。目前研究中，核苷类药物以其特异性干扰核酸的代谢、阻止细胞的分裂和繁殖的作用，被广泛应用到抗肿瘤、抗艾滋病等药物研发中，但是对其副作用尤其是针对胃反应的副作用，还有待深入研究。

近来报道，细胞外核苷例如ATP和UTP，可以引起胃平滑肌的收缩。另一种细胞外核苷四磷酸脲腺苷 （dinucleotide uridine adenosine tetraphosphate，Up4A），是一种新被认定为可以诱导血管平滑肌收缩的内皮衍生的收缩因子，而Up4A是否能引起胃平滑肌的收缩尚不清楚。

已知ATP和UTP可以作用于P2X和P2Y受体，激活信号通路，引发不同的反应，其中就包括平滑肌收缩反应。另外，环氧合酶抑制剂吲哚美辛也能抑制离体肠平滑肌的收缩。与此同时，有报道称Up4A，可以在大鼠肺动脉平滑肌［2］和主动脉平滑肌中［3］引起收缩。但胃平滑肌中对这几种药物的反应机制还有待进一步研究，为此，我们比较了胃纵行肌和环形肌分别对上述三种药物的反应。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

雄性 Wistar大鼠（6～8周龄，250～300 g）购自军事医学科学院实验动物中心。ATP和UTP购自Thermo Scientific公司。Up4A购自 BioLog公司，Nimodipine，indomethacin，α，β-me-ATP，suramin，IP5I and Y-27632均购自Sigma公司。

1.2 组织分离与收缩测定

胃纵行平滑肌和胃环行平滑肌从雄性Wistar大鼠体内取得。实验前大鼠禁食24 h，处死后迅速剖开腹腔，取得全胃。沿胃小弯剪开，暴露黏膜，用Krebs-Henseleit缓冲液漂洗，Krebs-Henseleit缓冲液的成分（mmol／L为：NaCl（118），KCl（4.7），CaCl2（2.5），MgCl2（1.2），NaHCO3（25），KH2PO4（1.2）and D-glucose（10），pH 7.2。缓冲液在 37°C，95%O2和5%CO2环境下平衡。用显微剪分别沿纵行肌和环行肌纤维的方向切取肌肉。分别将LM和CM切为3 x 10 mm的条形肌肉。将肌肉一端用丝线固定在支架上，放入内置Krebs-Henseleit缓冲液的塑料肌肉槽中，另一端用丝线与张力换能器相连。设置起始静息张力为20 mN，平衡1 h。在所有组织中均加入50 mmol／L KCl引起收缩，其余药物的收缩以 50 mmol／L KCl收缩的百分比表示（%KCl）。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0软件，数据以均数±标准差（¯x±s）的形式表示。各组数据采用Student T-Test进行统计学处理，组间用ANOVA分析。

2 结果

2.1 ATP，UTP和Up4A对LM和CM收缩的影响

不同浓度的ATP，UTP和Up4A，分别作用于LM和CM，均能引起LM和CM的收缩，反应呈浓度依赖性增强。可以看出，同等浓度下，ATP在LM中引起的收缩小于CM（图1A），UTP在LM中引起的收缩同样小于 CM（图1 B），而 Up4A在大于 10μmol／L浓度的情况下。在LM中引起的收缩大于CM（图1 C）。

2.2 IP5I在LM和CM中对Up4A引起的收缩变化

为了采用非选择性P2X受体抑制剂IP5I检测P2X受体是否参与在胃平滑肌收缩中的作用，。在基础张力下，在LM和CM中加入5μmol／L Up4A引起肌肉收缩，之后将Up4A用Krebs-Henseleit缓冲液洗掉，平衡 30 min后，加入 20μmol／L P2X IP5I，并孵育 30 min，加入 5μmol／L Up4A（图 2 A、图 2 B）。LM的Up4A收缩大小（64.26±4.65）%，CM的 Up4A收缩为（69.57±6.60）%，经过 IP5I孵育后，LM的Up4A收缩大小（60.94±7.89）%，CM的 Up4A收缩为（63.72±4.45）%，其收缩并未出现明显抑制（图 2 C）。

Fig.1 Contractile responses induced by ATP，UTP and Up4A in rat gastric LM and CM preparations In tissue bioassay，rat gastric LM and CM tissues were treated with A：ATP；B：UTP；C：Up4A at the concentrations indicated.The y-axis in C represents contractile responses standardized using the KCl（50 mmol／L）responses in the same tissues.Each data point represents the¯x±s（ATP，n＝8；UTP，n＝8；Up4A，n＝5）

2.3 Suramin在CM中对Up4A引起的收缩变化

采用非选择性P2Y受体抑制剂suramin检测P2Y受体是否参与在胃平滑肌收缩中的作用。在基础张力下，在LM和CM中加入5μmol／L Up4A引起肌肉收缩，之后将Up4A用Krebs-Henseleit缓冲液洗掉，平衡30 min后，加入10μmol／L P2Y受体抑制剂Suramin，并孵育 30 min，加入 5μmol／L Up4A（图 3 A、图3 B）。LM的 Up4A收缩大小（55.57±7.43）%，CM的 Up4A收缩为（52.95±10.43）%，经过 suramin孵育后，LM的 Up4A收缩大小（49.78±8.06）%，CM的Up4A收缩为（4.52±1.66）%。LM中，suramin并不能抑制Up4A引起的收缩，而在CM中，suramin能显著抑制Up4A引起的收缩（图3 C）。

Fig.2 IP5I does not attenuate Up4A-induced contractions in LM and CM preparations（¯x±s，n＝7）A：LM；B：CM；C：Up4A；LM：Longitudinal muscle；CM：Circular muscle；Up4A：Uridine adenosine tetraphosphate

Fig.3 Suramin inhibits Up4A-induced contractions in CM，but not LM preparations（¯x±s，n＝9）A：LM；B：CM；C：Up4A；LM：Longitudinal muscle；CM：Circular muscle；Up4A：Uridine adenosine tetraphosphate*P＜0.05 vs LM

2.4 吲哚美辛在CM中对Up4A引起的收缩变化

采用环氧合酶抑制剂吲哚美辛检测环氧合酶是否参与在胃平滑肌收缩中的作用。在基础张力下，在LM和CM中加入5μmol／L Up4A引起肌肉收缩，之后将Up4A用Krebs-Henseleit缓冲液洗掉，平衡30 min后，加入 100 nmol／L吲哚美辛，并孵育30 min，加入 5μmol／L Up4A（图 4 A、图4 B）。LM的 Up4A收缩大小（47.35±5.92）%，CM的 Up4A收缩为（50.55±3.89）%，经过吲哚美辛孵育后，LM的Up4A收缩大小（40.35±9.33）%，CM的 Up4A收缩为（11.16±3.55）%。LM中，吲哚美辛并不能抑制Up4A引起的收缩，而在CM中，吲哚美辛能显著抑制Up4A引起的收缩（图4 C）。

Fig.4 Indomethacin inhibits Up4A-induced contractions in CM preparation（¯x±s，n＝6）A：LM；B：CM；C：Up4A；LM：Longitudinal muscle；CM：Circular muscle；Up4A：Uridine adenosine tetraphosphate*P＜0.05 vs LM

3 讨论

细胞外核苷是NANC神经介导消化道反应的主要神经递质之一，在1970年，Burnstock和他的同事们首次提出ATP为NANC神经递质。最近Jankowski等人发现尿四磷酸脲腺苷是一种潜在的诱导血管平滑肌收缩的内皮衍生的收缩因子［4］。许多研究者报道了体内或体外实验均证实了Up4A可以在非疾病动物模型中调节血管收缩活性。由于Up4A兼具嘌呤和嘧啶特性，这些研究主要着眼于Up4A与嘌呤受体之间的关系。

根据药理学性质分类，嘌呤受体包括两种亚型：P1受体（或称腺苷受体）和 P2受体［5-7］。腺苷受体及磷酸化腺苷受体，ATP和ADP，分别是P1和P2受体的内源性配体。P1受体包括四个亚型：分别命名为A1，A2A，A2B和 A3。P2受体包括两个主要家族：P2X受体和 P2Y受体［8，9］。

本实验中 ATP，UTP在 100 nmol／L～100μmol／L浓度范围内引起大鼠胃纵行肌与环形肌的收缩反应，且随浓度增高，收缩反应呈浓度依赖性增强。在超过 100μmol／L浓度后，药物反应趋于饱和。而Up4A在在 100 nmol／L～10μmol／L浓度范围内能引起大鼠胃纵行肌和环形肌浓度依赖性收缩，在超过10μmol／L浓度后，药物反应趋于饱和。

Gui等人研究了Up4A在大鼠肺动脉中的作用和信号机制［2］。Up4A在离体大鼠肺动脉中，可以引发浓度依赖性的收缩。Up4A诱导的大鼠肺动脉收缩可被suramin所抑制，但不能被P2X受体拮抗剂IP5I或用α，β-methylene-ATP对 P2X受体脱敏的方法所抑制。在本实验中，LM和CM中加入P2X受体的非选择性抑制剂IP5I，均不能明显抑制Up4A引发的收缩。提示在LM和CM中，P2X受体可能并未参与Up4A引发的收缩，同时也验证了Gui等人的实验结果。

Suramin是一种P2X和P2Y嘌呤受体的非特异性拮抗剂［10］。某些P2Y受体对suramin的抑制作用比其它受体更为敏感。先前的研究表明，200μmol／L的suramin可以显著降低ATP对大鼠胃基底环行平滑肌的舒张，并抑制ATP对LM的收缩［6］。我们的结果显示，非选择性P2Y受体拮抗剂suramin可以显著抑制Up4A在CM中的收缩，但不能抑制在LM中的收缩，这表明，很可能有两种不同的P2Y受体亚型参与Up4A对平滑肌的收缩作用。这些受体亚型在CM中对suramin的抑制更为敏感。使用非选择性环氧合酶抑制剂吲哚美辛（100 nmol／L），可以抑制Up4A所引起的对CM的收缩，但对LM无影响，这显示环氧合酶可能参与胃环形平滑肌的收缩。

我们的研究证实了两种不同的平滑肌对胞外核苷的收缩反应不同，提高细胞外核苷水平和／或降低细胞外核苷的释放与活性能够作为减轻胃肠动力障碍的药物靶点。为今后设计安全有效的新型胞外核苷类药物，减少此类药物对胃的刺激提供了数据。

［1］ Bennett MR.Non-adrenergic non-cholinergic（NANC）to smooth muscle：35 years on［J］.Prog Neurobiol，1997，52（3）：159-195.

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