2.3ATA纯氧暴露不同时间大鼠肺组织中PKC表达的变化*

马 骏，方以群，王芳芳，李开诚

（海军医学研究所，上海200433）

氧气被广泛的应用于治疗临床疾病和潜水作业，但是当机体过长时间呼吸高分压氧气会导致肺型氧中毒。高分压氧气在肺组织内产生过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），损伤肺组织上皮细胞和血管内皮细胞，炎性细胞渗入肺泡，形成炎症，影响肺组织气体交换，最终可能造成死亡。这是肺型氧中毒的一般的病理生理过程。新近的研究表明发生肺型氧中毒的动物肺组织中凋亡细胞数量有明显的增加，提示了细胞凋亡在肺型氧中毒的发病过程当中起着重要的作用。但是这种情况下的细胞凋亡是如何调控的，目前还缺乏充分的研究。

蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）属于丝氨酸／苏氨酸激酶家族。PKC有至少10个亚基，在不同组织中有不同的表达。PKC分为三组：（1）经典 PKC：包含α，βI，βII，γ；（2）新型 PKC：包含δ，ε，η，θ；（3）非典型 PKC：包含ζ，λ。PKC的激活出现在各种病理变化中，如：肿瘤、疼痛、糖尿病、中风、早老性痴呆以及心力衰竭等疾病。研究表明PKCδ的活化参与了细胞凋亡的调控［1］。这种调控表现为促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡两方面。在肺型氧中毒的细胞凋亡过程中是否有PKCδ的活化，目前还没有研究。本研究初步探讨肺组织中的PKCδ在氧中毒下活性变化。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

小型实验用动物氧舱（海军医学研究所），液氮罐（YDS-35-125，四川亚西机器厂），超低温冰箱（ULT-1386-3-V，Thermo），高速离心机（3k30，SIGMA）。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠，30只，体重200 g左右，购于复旦大学实验动物科学部。

1.3 实验分组

随机将大鼠分为对照组和2.3ATA纯氧暴露2、6、10 h组和常氧高分压氮组（n＝6）。

1.4 处理方法

对照组和实验组动物均正常饮食，在氧舱内适应1 d后进行实验。对照组不进行纯氧暴露，不经过加压及减压程序，在舱内适应结束后即处死取材。2.3ATA纯氧暴露的动物在舱内经过适应后，在舱内放置钠石灰，关闭舱门，纯氧通风。测氧浓度大于99%后停止通风并立即加压，经10 min匀速加压至2.3ATA，停止加压，小流量通风并保持舱内压力不变，每20 min测量舱内氧气浓度和二氧化碳浓度，使氧浓度大于99%，二氧化碳浓度小于0.05%。不同实验组分别在此条件下暴露2、6、10 h，然后经5 min减压至160 kPa并停留5 min，再经5 min减压至130 kPa并停留5 min，再经5 min减压出舱。常氧高压氮组小鼠拟排除压力作用，应用常氧高压氮混合气加压，氮气浓度为91%，二氧化碳浓度小于0.05%，暴露10 h，减压前应用压缩空气置换舱内的氮氧混合气，加减压程序同2.3ATA纯氧暴露组。

1.5 取材方法

动物出舱后用0.1%戊巴比妥1 ml麻醉，腹主动脉放血处死，开胸取肺组织0.1 g左右，去除肺组织表面血污，置入液氮速冻，后转入超低温冰箱保存，准备进一步处理。

1.6 免疫印迹法

大鼠肺组织，用 RIPA（50 mmol／L Tris，150 mmol／L NaCl，0.1%Triton-100，10%glycerol，0.5 mg／ml BSA and protease inhibitors）4℃裂解。样品处理后进行SDS-PAGE电泳，再被转移到多聚二氟乙烯膜上，膜用含5%脱脂牛奶和0.1%Tween 20的TBST缓冲液封闭1 h（室温）。然后分别按需要使用PKCδ、p-PKCδ抗体 1∶2 000，购自 Sigma公司）、小鼠抗肌动蛋白抗体 （1∶50 000；Chemicon），在 4℃条件下杂交过夜。用连有辣根过氧化物酶的相应二抗杂交，并用TBST漂洗之后，由ECL显影液显影曝光。

用ImageQuant 5.1测定蛋白杂交的ECL信号强度，计算上述分子与肌动蛋白强度之间的比值。以每次实验相应的对照组进行标准化。

1.7 统计分析

本实验所有数据以均数±标准差（¯x±s）表示，应用SPSS软件包对样本进行方差分析。

2 结果

研究发现，在 2.3 ATA的纯氧处理 2、6、10 h，同时以未处理和2.3 ATA的常氧高分压氮气处理10 h的大鼠为对照，2.3 ATA纯氧处理 2 h，大鼠肺组织p-PKCδ有所降低；暴露6 h、大鼠肺组织p-PKCδ明显降低；处理时间 10 h、大鼠肺组织p-PKCδ有所恢复。而对照组中肺组织p-PKCδ无明显改变。各组间PKCδ表达量没有明显差别（图1）

Fig.1 Effect of hyperbaric oxygen on PKCδactivity in rat lung*P＜0.05 vs control group

3 讨论

在我们的前期研究当中发现随着纯氧暴露时间的延长，动物肺组织水肿程度加重，血细胞渗出增多，提示了肺型氧中毒程度逐渐加深［2］。随着肺型氧中毒程度的加深，PKCδ的表达含量并没有明显的变化。但是其活性形式p-PKCδ的含量在0～6 h时逐渐降低，提示其活化受到抑制；6 h后含量逐渐恢复，这可能是抑制活化因素解除或者促进活化因素增强造成的。结合肺组织在6 h后遭到严重的破坏的前期实验结果，抑制因素由于组织细胞的破坏而解除的可能性更大。

组织内过量的ROS可以直接对细胞产生毒性作用，导致细胞坏死和细胞凋亡。研究表明肺泡上皮细胞和血管内皮细胞发生细胞凋亡在肺型氧中毒的发病过程当中起着重要的作用［3］。而PKCδ可以对细胞凋亡过程进行调节，从而控制个体的发育和疾病的进程。研究表明PKCδ可以通过3种方式活化：与甘油二酯（DAG）结合、经蛋白酶水解和磷酸化。活化的PKCδ在特定的细胞、特定的环境下可以表现为抑制细胞增殖、促进或抑制细胞凋亡等作用［4］，从而参与到机体的病理生理过程当中。我们的研究发现氧中毒后，p-PKCδ在2.3ATA处理2 h就有轻微的降低，6 h就降到最低，到了处理10 h，反而有所恢复。这与我们前期在背根神经节上氧中毒后ERK变化一致，但迟于细胞凋亡的变化［5］。p-PKCδ的变化提示其在肺型氧中毒的发生过程中可能起到抑制细胞凋亡的作用，从而减轻组织的氧化损伤。氧中毒后 p-PKCδ与正常相比是降低的，而在其它疾病中，PKC往往是被激活的。这里面可能存在不同的作用机制需要我们更进一步的研究。

［1］ Brodie C，Blumberg PM.Regulation of cell apoptosis by protein kinase c delta［J］.Apoptosis，2003，8（1）：19-27.

［2］ 马 骏，方以群，孟 淼，等.230 kpa纯氧暴露不同时程小鼠肺组织tlr4基因表达变化［J］.中华航海医学与高气压医学杂志，2010，17（1）：13-15.

［3］ Pagano A，Barazzone-Argiroffo C.Alveolar cell death in hyperoxia-induced lung injury［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，1010：405-416.

［4］ Zhao M，Xia L，Chen GQ.Protein kinase cdelta in apoptosis：A brief overview［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2012，60（5）：361-372.

［5］ Li KC，Bao XC，Fang YQ，et al.Different activation of ERK1／2 and p38 with hyperbaric oxygen in dorsal root ganglion［J］.Undersea Hyperb Med，2011，38（2）：149-153.