依达拉奉对小鼠肺型氧中毒的保护作用及其机制*

包晓辰, 方以群, 马 骏, 王芳芳

(海军特色医学中心潜水医学研究室，上海 200433)

氧气是维持生命的必要条件，被广泛应用于潜水作业、高压氧治疗及呼吸机辅助支持治疗中。如常压氧气常被用来治疗各种缺氧性疾病，高压氧气(氧气绝对压大于1.0 ATA)被用来治疗减压病、股骨头坏死等疾病。但长时间暴露于氧气中会导致氧中毒的发生。肺组织是直接接触氧气的部位，有大量的对氧毒性敏感的上皮细胞，从而成为氧中毒的主要靶器官之一，导致肺型氧中毒的发生[1-3]。目前对于肺型氧中毒尚无有效的治疗方法。

依达拉奉是一种神经元保护剂，临床上主要用于治疗缺血性脑血管疾病。目前多项研究发现依达拉奉可通过清除羟自由基、提高体内抗氧化酶活性、减轻炎症反应及降低细胞凋亡等对脓毒症、百草枯等导致的急性肺损伤起到保护作用[4]。炎症及凋亡是肺型氧中毒的主要发病机制，本文拟在高压氧致肺型氧中毒的小鼠模型中探讨依达拉奉的预防作用及干预机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

30只雄性C57BL/6小鼠，体重(29.81+0.49)g，购买于上海毕凯实验动物公司。实验前1周饲养于海军医学研究所动物中心。动物分为3组(n=10)：空气对照组;高压氧暴露组，暴露在2.5 ATA，≥95%氧气中6 h; 高压氧依达拉奉干预组(高压氧+依达拉奉)。依达拉奉溶于无菌水，5 mg/kg，腹腔注射。每日1次，连用3 d。高压氧暴露组及空气对照组腹腔注射等量灭菌水作为对照。

1.2 试剂

兔抗鼠的cleaved-caspase-3、total caspase-3抗体、蛋白裂解液及二抗抗体购自美国cell signial公司，蛋白酶抑制剂购自美国thermo公司，兔抗鼠的Actin抗体购自美国abcam公司。IL-6、IL-1β的ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司。超氧化物酶岐化物(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒购自美国 R&D 公司。

1.3 高压氧暴露方案

高压氧暴露组及高压氧依达拉奉干预组动物置于氧舱内，氧舱内放置二氧化碳吸收剂(碳酸钙)。100%氧气洗舱10 min后，缓慢加压至0.23 MPa，共暴露6 h。保持小流量(5 L/min)纯氧持续通气，将舱室CO2浓度保持在<300 ml/m3。期间连续监测氧气含量，并保持氧气含量≥95%。暴露结束后，5 min内匀速减压出舱。空气暴露组小鼠置于氧舱内呼吸常压空气6 h。

1.4 组织病理分析

小鼠出舱后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取右上肺叶4%多聚甲醛固定，后置20%蔗糖溶液(4℃)中过夜。石蜡包埋，切片，贴片。一部分切片采用苏木精及伊红染色后，行常规病理分析。

1.5 肺组织湿干比测定

取右下肺组织，称取各个肺组织的湿重后，置于80℃烤箱中烘烤48 h后，称取干重，计算湿/干重的比例。

1.6 ELISA检测细胞因子

取左肺组织，在蛋白裂解液中裂解后，1 000× g，4℃离心10 min，取上清液，测定蛋白含量。按照试剂盒说明，检测IL-6及IL-1β在肺组织中的含量。

1.7 抗氧化酶含量检测

取上述肺组织裂解液上清，按照试剂盒说明，加入反应体系中，裂解液中的抗氧化酶和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB，通过每隔30 s，共5 min测定550 nm处的吸光度，检测黄色底物TNB的生成量，按照公式计算肺组织中抗氧化酶GSH及SOD的含量。

1.8 Western blot检测凋亡蛋白

取上述肺组织裂解蛋白，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5 min，等量样品加入电泳槽中，浓缩胶90 V电泳15 min，10%分离胶120 V电泳90 min后。400 mA恒流转膜150 min，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h。分别与一抗cleaved-caspase-3、total caspase-3(1∶1 000)，Actin(1∶8 000)4℃孵育过夜。TBST洗脱15 min×3次后，二抗室温孵育1 h，TBST洗脱15 min×3次，ECL液显影，胶片曝光。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 依达拉奉对高压氧导致的肺损伤的影响

病理组织分析结果：高压氧暴露组的肺组织呈现明显的肺泡壁增厚、组织出血及炎症细胞浸润等肺型氧中毒的病理特征。依达拉奉可明显减轻这些病理特征(图1)。和空气对照组相比较，高压氧暴露后肺组织湿/干比明显上升(4.81±0.25vs4.47±0.11，P<0.01，n=9)，提示肺水肿的存在，而依达拉奉预防性应用可显著降低高压氧导致的肺水肿,依达拉奉组肺湿/干比和空气对照组相比较，无统计学差异(4.62±0.16vs4.47±0.11，n=9，P>0.05，图1)。

Fig. 1 Effects of edaravone on pulmonary oxygen toxicity as determined by histological analysis(HE ×200)and wet/dry(W/D)lung weight ratio(n=9)

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

**P<0.01vsAir + vehicle group

2.2 依达拉奉对高压氧导致的肺组织炎性因子表达的影响

和空气对照组比较，高压氧暴露组小鼠肺组织中IL-1β的含量显著升高(P<0.01，n=9)，而依达拉奉干预组的IL-1β的含量和高压氧暴露组相比明显降低(P<0.01，n=9)。IL-6的含量在各组小鼠肺组织中无明显改变，三组之间均无统计学差异(P>0.05，n=9，表1)。

GroupIL-1βIL-6Air+Vehicle532.28±127.23∗∗129.57±32.82HBO+Vehicle735.06±122.61115.44±38.74HBO+YD521.14±113.23∗∗120.73±41.44

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

**P<0.01vsHBO + vehicle group

2.3 依达拉奉对抗氧化酶活性的影响

和空气对照组相比，GSH在高压氧暴露组及依达拉奉干预组中都显著下降(P<0.05，n=9)，而高压氧暴露组和依达拉奉干预组之间无明显统计学差异(P>0.05，n=9)。与空气对照组相比，SOD的表达量在高压氧暴露组及依达拉奉干预组中显示下调趋势，但无明显统计学差异(P>0.05，n=9，表2)。

GroupGSHSODAir+Vehicle25.11±6.5322.84±6.82HBO+Vehicle18.47±1.71∗19.67±4.40HBO+YD16.58±2.58∗∗25.11±6.53

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

*P<0.05，**P<0.01vsAir + vehicle group

2.4 依达拉奉对高压氧导致的肺组织细胞的凋亡的影响

和空气对照组比较，高压氧暴露组小鼠肺组织的凋亡蛋白cleaved-caspase3表达明显升高(P< 0.05，n=5)，而依达拉奉干预组的cleaved-caspase3的值和高压氧暴露组相比明显降低(P<0.05，n=5，图2)。

Fig. 2 Effects of edaravone on the expression levels of cleaved caspase-3, caspase-3 proteins(n=5)

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

*P<0.05vsHBO + vehicle group

3 讨论

持续暴露于高压氧环境下可产生氧自由基。氧自由基可导致显著的肺损伤，如肺泡渗透性增加，肺水肿，细胞凋亡及炎症因子的上调[5, 6]。目前针对肺型氧中毒没有有效的治疗方法。依达拉奉是一种神经元保护剂，临床上主要用于治疗缺血性脑血管疾病。目前多项研究发现依达拉奉可通过清除羟自由基、抑制脂质过氧化，抑制白三烯的生成，保护内皮细胞[7]。研究证实依达拉奉对急性肺损伤也具有保护作用，如可通过升高抗氧化酶活性、减少致炎性因子分泌对百草枯中毒导致的肺损伤起到保护作用[8]；可通过减少氧自由基产生、降低NF-κB信号通路转导降低脓毒症导致的肺损伤[9]。

本研究结果首次探讨了依达拉奉在肺型氧中毒中的保护作用。结果显示依达拉奉预防性使用可有效降低肺型氧中毒小鼠肺组织的损伤及高渗透性，同时抑制炎症因子及细胞凋亡蛋白。炎症是氧中毒导致肺损伤的重要表现之一。体内富集的氧自由基可影响细胞代谢、信号传导及功能，从而导致细胞损伤，增加前致炎性因子IL-1β、IL-6等的分泌[10]。本研究结果显示依达拉奉可有效逆转肺型氧中毒导致的IL-1β的升高。

凋亡是肺型氧中毒的另一重要表现[11]。tunel染色及cleaved-caspase-3表达水平增加提示肺型氧中毒时肺泡上皮细胞可发生凋亡。而caspase-3基因敲除小鼠在常压氧中暴露72 h后，肺上皮细胞凋亡比率明显比野生型小鼠增大[12]。这提示caspase-3基因激活在肺型氧中毒导致的肺上皮细胞死亡中起着重要作用。在本实验中我们检测了各组小鼠肺组织中cleaved-caspase-3的表达变化。结果显示相对于常压氧对照组大鼠，高压氧暴露组肺组织中cleaved-caspase-3表达量明显增高，提示出现肺组织细胞凋亡，而依达拉奉的预防性使用可显著降低cleaved-caspase-3表达量，提示依达拉奉对肺型氧中毒的肺组织细胞凋亡具有抑制作用。

抗氧化酶是体内代谢氧自由基的主要途径，抗氧化酶活性的增高可有效降低氧自由基造成的损伤[13]。但在本实验中，结果显示高压氧暴露后GSH及SOD的含量和空气对照组相比有明显的下降趋势，而依达拉奉预防性使用对GSH及SOD的活性无明显影响。我们分析认为，首先高压氧暴露组抗氧化酶活性的降低，是由于体内的抗氧化酶过多的消耗导致，而依达拉奉组对抗氧化酶活性无影响，提示升高抗氧化酶活性不是依达拉奉在肺型氧中毒中的保护机制。

综上所述，预防性使用依达拉奉可通过降低炎性因子分泌及减少细胞凋亡对肺型氧中毒起到保护作用。