KCNJ11基因E23K基因多态对细胞膜电流的影响*

夏小慧，杨爱宏，胡 扬

KCNJ11基因编码内向整流型钾离子通道蛋白Kir6.2，主要存在于心肌、骨骼肌、胰腺β-细胞、脑神经元等处［1，2］。细胞内 ATP／ADP的变化、4，5-二磷酸肌醇以及长链乙酰辅酶A均能激活该通道。在运动过程中，能合理调节心脏对外界应急反应的适应能力，被认为是心脏的能量感受器。

KCNJ11基因位于11p 15.1区域，仅1个外显子，无内含子，编码一个390个氨基酸的多肽。E23K多态（rs5219，C595T）是位于该基因外显子处的错义突变。该基因编码蛋白是一种ATP敏感性钾离子通道，与能量代谢密切相关。大量研究表明，E23K多态与糖尿病［3］、心血管疾病［4］密切相关。我们推测，E23K变异可能会改变蛋白质性质，从而改变钾离子通道的电流。在此假设前提下，本研究利用全细胞膜片钳技术，分析携带不同等位基因的重组质粒转染真核细胞后，对细胞膜表面电流密度的影响，以探讨E23K多态与相关疾病关联的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒提取试剂盒、PCR试剂盒购自sangon公司；Taq聚合酶、Pfu酶、EcoR I、Xba I限制性内切酶等购自Progema公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM细胞培养液、胎牛血清、青霉素、胰蛋白酶等购自 Giboc公司；氯化钠、氯化钾、EDTA、HEPES、氯化镁、D-葡萄糖等购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

感受态细胞TOP10购自Novasygen公司，pcDNA3.1／CT-GFP质粒载体由兰州兽医研究所人兽共患病研究室惠赠。健康人基因组DNA由本课题组前期保存。

1.2 KCNJ11基因的扩增及表达载体的构建

根据已发表的 GenBank（NCBI Reference Sequence：NM-000525.3）中的 KCNJ11序列设计引物F、R，上下游引物 5＇端分别加载 EcoR I和 Xba I酶切位点和保护碱基。以健康人基因组DNA为模板，PCR扩增KCNJ11基因外显子。将扩增产物纯化后，通过连接、转化后插入pcDNA3.1／CT-GFP载体。测序得到多态位点为G（对应于氨基酸E）的重组载体。载体命名为 pcDNA3.1-KCNJ11（E）（图 1）。

Fig.1 Restriction endonuclease digestion confirmations of recombinant plasmid1：Digestion fragments by EcoR I and Xba I；M：DNA marker

根据突变位点，设计突变引物Fm和Rm。以pcDNA3.1-KCNJ11（E）为模板，以 F和 Fm、R和 Rm引物对分别进行PCR扩增，所得PCR产物I和产物II经纯化后等比例混合。取混合物为模板，以F和R引物对进行扩增，纯化回收PCR产物，经连接、转化后插入 pcDNA3.1／CT-GFP载体。测序得到多态位点为A（对应于氨基酸K）的重组载体。载体命名为pcDNA3.1-KCNJ11（K）。本研究所用引物序列见表1。

Tab.1Primers for amplification

1.3 细胞转染

HEK293T细胞在 DMEM培养基中（含 10%FBS），37℃，5%CO2，100%相对湿度条件下常规培养。当细胞浓度达2×105cells／ml时，用重组质粒（除去内毒素）pcDNA3.1-KCNJ11（K）、pcDNA3.1-KCNJ11（E）分别转染细胞。转染试剂为 Lipofectamine 2000，转染过程严格按照转染说明书进行。转染后24～48 h在荧光显微镜下观察细胞转染效率，选边缘整齐、表面光滑，有绿色荧光的细胞进行电生理测定。

1.4 电生理记录

配制细胞外液（mmol／L：NaCl：140，KCl：5.4，Ca：1.8，MgCl2：0.5，NaH2PO4：0.33，HEPES：5，葡萄糖：5.5，用 NaOH调 pH 7.4）、细胞内液（K：130，MgCl2：1，磷酸肌酸二钠盐：5，天冬氨酸：90，EGTA：10，HEPES：5，用 KOH调 pH 7.4）。通过三维操纵仪（MP285R，Sutter）使电极与细胞表面形成高阻封接及全细胞记录模式，电流信号经Axon 700B放大器（Axon）进行处理。钳制电压为由-150 mV至60 mV，阶跃电压：10 mV，采样时间：250 ms。采样频率：5 KHz。用pClamp9软件（Axon）进行数据分析。由电流振幅与电容的比值计算电流密度（pA／pF）。数据以平均数±标准差表示。对两组数据进行T检验。

2 结果

2.1 目的基因的获得和表达载体的构建

成功扩增到大小为1 173 bp的片段，并将其插入pcDNA3.1载体。测序结果表明，与GenBank公布的KCNJ11基因序列相比，同源性为99.6%（图1）。

图 2所示为构建的 pcDNA3.1-KCNJ11（E）、pcDNA3.1-KCNJ11（K）重组质粒部分测序图，箭头所示为突变位点。结果表明，构建的两个载体仅有突变位点差异，其余序列均一致。

2.2 细胞转染

细胞转染结果表明，重组质粒成功转染入HEK293T细胞，并在细胞内表达，平均转染率为13.6%。内有绿色荧光者表示已转染并KCNJ11基因成功表达的细胞（图3）。

Fig.2 Sequenced recombinant plasmid fragments

Fig.3 HEK293T cells after transfected

2.3 细胞膜电流密度测定

全细胞膜片钳记录结果显示，pcDNA3.1-KCNJ11（E）转染后的细胞中记录到了相对较强的电流，而pcDNA3.1-KCNJ11（K）转染后的细胞中记录到的电流明显弱（图4）。

Fig.4 Currents in transfected cell was investigated using patch clampA：pcDNA3.1-KCNJ11（E）；B：pcDNA3.1-KCNJ11（K）

当钳制电压为由-150 mV渐变为＋60 mV，根据电流随电压的变化绘制电压电流关系曲线（图5）。电流正值为外向电流，电流负值为内向电流。在两种不同质粒转染后的HEK 293T细胞中，其细胞膜的反转电位约为-50 mV，内向电流与外向电流大小相近。而在pcDNA3.1-KCNJ11（K）转染后的细胞中，内向电流和外向电流均明显减少。T-检验结果显示，两组细胞表面电流对比有显著性差异（P＜0.05）。

Fig.5 I／V curves of ATP-sensitive K＋（KATP）channels after transfected difference recombinant plasmids（n＝10）

3 讨论

KCNJ11基因编码的Kir6.2蛋白分布于心肌、骨骼肌、平滑肌、内分泌细胞等，其生理功能是维持细胞静息电位，调节骨骼肌、血管平滑肌的舒缩等，并参与多种生理功能：如胰腺胰岛素的分泌、心肌缺氧的保护功能等。钾离子通道的特征是其开放活性受胞内ATP的调节，ATP及磺酰脲类药物抑制其开放，而ADP及其它二磷酸核苷促其开放。KCNJ11基因编码蛋白的通道上，发现许多影响ATP敏感性的氨基酸位点和区域［5］，如 R50、K185、R201、G334等四个位点共同形成一个ATP结合槽，其中任何一个氨基酸的改变会使通道对ATP的敏感性极大降低，甚至消失。

体外表达系统是研究离子通道电流特征的一个重要途径［6］，而膜片钳技术被认为是研究离子通道的“金标准”。离子通道的特征，一定程度上依赖于使用的表达系统。如植物钾离子通道蛋白KAT1在蛙卵中的激活电位接近-80 mV，而在昆虫细胞中的接近-60 mV［7］。本实验中，测到的细胞膜电流较小，最大为20 pA／pF，最小为-23 pA／pF。这可能与表达载体的类型、转染细胞以及实验条件有关。由于本研究两组转染质粒只有一个位点差异，其余条件均一致，因此对比两组转染质粒的电生理功能，结果可靠。

E／K突变是KCNJ11基因中研究最多的多态位点。大多数研究认为该位点多态与糖尿病相关联，但结果又不尽一致［8，9］。对各独立研究进行合并统计分析，提示KCNJ11基因KK基因型可能是Ⅱ型糖尿病发病的危险因子［10］。通过构建分子模型显示，Kir6.2通道结构中，E23残基在胞内功能性的α-螺旋区，而E残基被K取代后，该氨基酸残基带有相反的电荷，有可能导致结构重排以及Kir6.2亚基相邻的内部结构断裂，特别是在纯合子状态下，这种作用更为明显。也有研究认为，由于KATP通道是由一个内向整流性钾通道（Kir6.2或Kir6.1）和一种 ATP结合蛋白—磺酰脲类受体（SUR1或SUR2）组成的异聚体［11］，在 ABCC8基因（编码 SUR1蛋白）上有一个敏感的S1369A多态位点，是KCNJ11基因E23K位点与ABCC8基因S1369A位点共同作用改变了离子通道的ATP敏感性［12］。还有研究认为，钾离子通道电流的变化依赖于ABCC8中A1369变异的存在，而不是KCNJ11中K23［7］。而在本研究中，两个转染质粒只有E／K位点不同，其余条件均相同，而检测结果细胞表面电流发生了明显变化，说明E23K多态位点单独可以改变离子通道的功能，从而改变细胞相关特性。

总之，人 KCNJ11基因 E23K通过异源表达载体，转染293T细胞后，细胞表面电流发生了明显改变，表明KCNJ11基因外显子E23K多态能导致细胞膜电流发生改变。为进一步研究多态位点与相关疾病的关联机制提供实验基础。

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