神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络*

李瀚旻

湖北中医药大学附属医院肝病研究所(湖北 武汉，430061)

肝脏再生(简称肝再生)是一种非常显著的再生修复反应，可以使肝脏的组织结构和功能得到完全恢复。肝再生的调控机制极其复杂，其中神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络是其重要环节［1，2］。在神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络紊乱的状态下，正常的肝再生修复反应常被干扰以致出现不完全再生，或难于再生，或再生不足，或无序再生(质量表达紊乱、空间分布失衡、时间次序失常)，是肝脏病证发生发展的关键共同环节，故肝再生调控成为前景广阔的防治肝脏病证的策略及方向。

1 肝再生调控的3 种方式

肝再生过程中细胞与细胞之间相互作用的桥梁主要来自于细胞因子，根据这些细胞因子对肝再生的正负调控作用，目前将调控肝再生的细胞因子主要分为促进肝再生、抑制肝再生和双向调节肝再生的3 大类细胞因子。许多细胞因子(IFN、TGF-β、TNF、白介素等)在调控肝再生的同时，又影响肝损伤或调控免疫。目前认为，细胞因子对肝再生的调控至少存在自分泌、旁分泌及内分泌的3 种方式的调控机制。早期主要研究自分泌方式的调控机制，后来发现旁分泌方式的调控机制更为广泛，最近又证实了内分泌方式的调控机制的重要性。在所有的肝再生相关因子中，最强有力的致分裂增殖因子是肝细胞生长因子(HGF)［3］。Stoker 等首先从培养肝细胞液中，提取到一种有丝分裂原即HGF，具有促进肝细胞再生的作用，并证实HGF 通过肝细胞自分泌产生的方式。后来的研究均证实HGF 是培养肝细胞的强力促分裂增殖剂，HGF 的促肝细胞增殖作用强于EGF 或TGF-α 5～10 倍［4］。肝细胞DNA 合成启动前数小时内均发生HGF 受体c-met 的酪氨酸磷酸化，说明HGF 确实参与了促细胞分裂增殖信号的产生。

进一步研究发现，旁分泌是调控肝再生的广泛方式。调节肝脏细胞再生的细胞因子(HGF，TGF-α，TGF-β，等)主要来自于枯否细胞(KC)、星状细胞(HSC)等肝非实质细胞［5］。肝细胞与KC、HSC 在结构上的毗邻关系为实质细胞和非实质细胞的互相协调、互相影响奠定了形态学基础，KC 通过胞质突起附着于内皮细胞的窦侧或内皮细胞之间，有的突起穿过内皮细胞间隙或窗孔进入Disse 间隙，从而与肝细胞直接接触。KC 和HSC 位于肝血窦周围易与外源性物质接触而活化，产生一系列与肝再生调控相关的生物活性物质。KC 是肝脏的细胞因子库，激活后能释放大量细胞因子和生长因子。HSC 位于窦周隙内与内皮细胞和肝细胞相邻，近旁有中间微丝可收缩调节和感知血流。

有研究证实，肝外组织(肺、肾、脾，等)亦产生HGF，大鼠PHx (肝部分切除术)后1h，体内HGF 血浆水平即已升高，但PHx 后3～6h，Ito 细胞的HGF mRNA 表达开始增加。联体动物(血循环相通)的一只部分肝切除可引起另一只动物肝的增殖［6］。人肝PHx 后HGF 血浆水平持续升高，且先于肝内HGF mRNA 的表达，直到肝脏恢复原体积后下降。HGF 的迅速升高与血源性再生因子出现的时间动态学相吻合，亦与立即早期基因的迅速变化相吻合，这与HGF 导致某些立即早期基因(LRE-1 和IGFBP1)的表达密切相关。这些实验结果均提示影响肝再生过程的内分泌调控方式。

2 肝内微环境对肝再生的影响

肝再生的启动是由于肝损伤后肝脏微环境发生改变，增强了对即将死亡的受损细胞的清除和对损伤较轻细胞的修复，并通过存活的实质或非实质细胞增殖及肝内外干细胞增殖分化来取代死亡细胞。正常肝脏的成熟肝细胞基本保持不增殖状态，但肝损伤微环境的改变能使成熟肝细胞具有增殖能力的干细胞特性，能很快从基本不生长状态进入快速增殖状态，故学术界已将肝细胞划归肝干细胞范畴。

肝内微环境主要由肝脏干细胞/祖细胞与肝脏中的基质细胞(肝星状细胞、Kupffer 细胞及窦状内皮细胞)、免疫细胞、胞外基质以及神经系统所共同构成的组织微环境［7，8］。损伤的肝细胞、枯否细胞和肝星状细胞均参与炎症诱导。属于固有免疫及适应性免疫的炎症细胞均参与肝损伤和肝再生，肝损伤与肝再生平衡失调决定肝脏病的发生与发展。在肝内微环境中通过细胞接触，可溶性细胞因子和细胞外基质成分以及局部的三维组织结构影响干细胞的活性与功能，通过微环境的信号调控干细胞的增殖与分化，对称与非对称性分裂，支持干细胞的自我更新，组织器官胚胎发育和成体再生中的肝组织重构，以及生理性应激反应等［9］。包括胶原、非胶原结构糖蛋白、蛋白多糖在内的动态大分子复合物构成的肝脏胞外基质，在维持肝脏正常结构和细胞的增殖、迁移分化方面发挥重要作用。完全肝再生需要重新合成以前降解的胞外基质，内皮细胞需要与胞外基质接触来抑制接触诱导的凋亡。肝脏胞外基质还参与了新生肝细胞结节的窦状隙形成，窦状隙周围胞外基质的重建能稳定新产生的肝细胞［10～12］。

肝星状细胞作为肝脏中的基质细胞的成分之一，不仅在肝纤维化中扮演了重要角色，而且作为干细胞龛的组成部分在肝再生过程中也发挥了重要作用［13］。它通过细胞外基质的产生与重建、细胞因子的产生以及窦孔的改变来调节肝再生的过程，在肝脏中执行重要的生理功能。近些年来，有研究表明，肝星状细胞还具有多向分化潜能，在一定条件下可分化为肝细胞及血管内皮细胞，可直接参与肝损伤修复的细胞再生［14］。

3 肝外大环境对肝再生的影响

越来越多的临床观察和实验研究表明，肝再生过程并不仅仅是肝脏局部孤立的病理生理过程(肝内微环境对肝再生的影响)，而是整体调节的综合结果，其中包括肝外大环境对肝再生的影响和肝外大环境与肝内微环境相互作用的影响机制。最初发现肝外大环境对肝再生显著影响的事实是再生肝的体积变化随个体的大小而出现精确的适应性变化，有学者将一条大狗的肝脏移植到小狗的体内，被移植肝脏逐渐变小，直到与小狗较小的个体相协调［15］。将狒狒的肝脏移植到人的体内，肝脏会在一周左右增加重量和体积，直到适合较大的人体［16］。后来，有研究证实，在部分肝切除后期，细胞因子的肝外表达增加，如白色脂肪组织［17］，可以在肝损伤后导致全身性的细胞因子反应。IL-6 缺失受者的骨髓移植实验结果表明，骨髓来源的细胞是肝再生过程中IL-6 的另一细胞来源［18］。起源于肝内的损伤相关信号可以促进肝外组织释放活性因子(如生长调控激素、神经递质、有丝分裂原、细胞因子)，以增强肝脏局部再生修复效果。

研究自分泌、旁分泌对肝再生的调控机制主要揭示肝内微环境对肝再生的影响，研究内分泌对肝再生的调控机制可以从一个侧面揭示肝外大环境对肝再生的影响。内分泌受高级神经中枢调控，下丘脑是调节内分泌活动的中心环节，在下丘脑-垂体-性腺轴、下丘脑-垂体-胸腺轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-肾上腺轴广泛而深入研究的基础上，近几十年来，国内外学者已开始注重研究肝脏与高级神经中枢的关系。1982年在意大利Serono 召开的首届“内分泌与肝脏”专题讨论会提出了下丘脑-垂体-肝轴的新概念，并把肝脏视为是使激素和其他细胞调节因子协调统一的一个重要部位［19］。肝再生与神经-内分泌-免疫网络相互影响的结构功能系统构成了神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络。

早有研究证实，激素类(胰岛素、胰岛素样生长因子、胰高血糖素、甲状腺素、肾上腺素、去甲肾上腺素、瘦素等)对肝再生具有明确的调节作用，通过“二离子信号系统”可能是其作用机制之一。第一离子信号系统是通过调节单价阳离子(特别是Na+、K+)的流入而激活细胞膜系统。Na+迅速流入以交换H+，增强Na+-K+-ATP 酶活性，促进氨基酸转运、RNA 及蛋白质合成。第二离子信号系统是通过Ca++流入cAMP 电涌改变，提高胞浆cAMP 水平和DNA 合成率。肝脏切除后的应激反应通过下丘脑-垂体-靶腺轴促使甲状腺、胰腺和肾上腺分泌甲状腺素、胰岛素和肾上腺素以适应肝再生修复的需要［20］。

为深入研究神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络对肝再生的影响及机制，我们创建了MSG-肝再生-大鼠模型。左旋谷氨酸单钠 (Monosodium L-Glutamate，MSG)是一种神经毒素，大鼠出生后2、4、6、8、10d 皮下给予MSG，可选择性地破坏下丘脑弓状核(arcuate nucleus，ARN)，进而引起复杂的神经-内分泌-免疫功能紊乱，其下丘脑-垂体-靶腺轴的功能异常尤其突出。下丘脑-垂体-肾上腺轴功能呈病理性亢进，其可能机理为ARN 投射到室旁核(PVN)的抑制性纤维消失;下丘脑-垂体-性腺轴功能明显低下，机制可能为ARN 中黄体激素释放激素(LHRH)神经元破坏，LHRH 分泌减少及垂体对LHRH 的反应性减低，从而性腺的发育受到影响;下丘脑-垂体-甲状腺功能改变则有亢进和低下的不同报道。神经-内分泌系统与免疫系统存在密切联系，MSG-大鼠的细胞免疫功能显著受抑。MSG-肝再生-大鼠模型的创建为探讨病理状态(神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络功能紊乱)下的肝再生机制和药物筛选奠定了坚实的实验基础。实验结果表明，MSG-肝再生-大鼠模型肝再生过程严重失调，表现为初期(术后24h 以前)肝再生较快，中晚期肝再生过程则受到显著抑制，最终在肝再生度、肝细胞分裂指数和肝重/体重比值等方面均不能恢复到正常水平。提示MSG-肝再生-大鼠的肝再生过程受到肝外大环境的影响，包括高级神经中枢的调控，其调控的可能机制是通过下丘脑-垂体-肝轴与神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络影响模型大鼠的肝再生过程［21］。

4 肝内外环境对肝再生的相互影响机制

有学者总结分析肝内外HGF 的作用，认为HGF存在血源性肝细胞生长因子(HGF-h)和胞源性肝细胞生长因子(HGF-c)两种形式。HGF-h 作为早期信号，启动肝细胞分裂;而HGF-c 仅作用于感受态肝细胞，促进其分裂。正常情况下，肝脏可清除血循环中过量的HGF-h，使血浆中HGF-h 的含量维持在一定水平。当肝大部切除术后，由于大块的肝组织突然丢失 (肝脏清除HGF-h 的能力减弱或丧失)，使HGF 不能及时清除，从而血循环中出现高水平的HGF，导致血浆中HGF-h 的含量上升，通过内分泌方式使肝再生得以启动和进行。此后，肝脏内HGF-c开始产生，继续促进肝细胞分裂。随着肝再生的进行，重构的肝组织逐渐恢复清除HGF-h 的能力，血浆中HGF-h 的含量又很快恢复到正常水平，从而减轻、消除对肝外器官的影响。

我们在研究MSG-肝再生-大鼠肝内外环境对肝再生的相互影响机制后发现，MSG-肝再生-大鼠肝再生和下丘脑TGF-α、EGFR、TGF-β、TGF-βRⅠ、Ⅱ的基因表达失调，不仅表现在蛋白质水平上，而且在表现在转录水平上;不仅表现在空间上，而且表现在时间上;不仅表现在数量上，而且表现在质量上。MSG-肝再生-大鼠肝内外调控肝再生的基因表达失调的结果不仅最终表现为肝再生过程严重失常，而且能导致神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络的进一步紊乱［22～25］。

5 中药对神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络的作用

中药广泛用于急慢性肝病的治疗，其有效的作用机制可能是多途径、多层次、多系统、多靶点、多时限地调控肝再生过程，通过影响神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络可能是其重要环节，很值得系统深入地研究。为探讨左归丸通过影响神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络治疗肝脏病的作用及其机制，我们采用免疫组织化学方法观察左归丸影响MSG-肝再生-大鼠再生肝和ARN 的TGF-α、β 及其受体的表达;Dig 标记探针原位杂交法检测MSG-肝再生-大鼠再生肝和ARN的TGF-α、TGF-β1mRNA;RT-PCR 加Dot Blot 法定量检测MSG-肝再生-大鼠再生肝TGF-β1mRNA。结果发现，MSG-肝再生-大鼠与正常大鼠肝再生模型比较，其再生肝和ARN 中的TGF-α、TGF-αmRNA 和EGFR 表达显著下调，TGF-β1、TGF-β1mRNA、TGFβRⅠ和RⅡ表达显著上调，左归丸能显著上调MSG-肝再生-大鼠再生肝和 ARN 中的 TGF-α、TGFαmRNA 和 EGFR 的 表 达 和 下 调 TGF-β1、TGFβ1mRNA、TGF-βRⅠ和RⅡ的表达。提示左归丸可通过影响神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络在一定程度上改善MSG-肝再生-大鼠的肝再生过程［26～29］。为研究地五养肝胶囊(鄂药制字Z20113160)对MSG-肝再生-大鼠肝再生的影响及机制，采用复制MSG-肝再生-大鼠模型，观察地五养肝胶囊对其肝再生紊乱的调控作用，免疫组织化学法检测肝组织和垂体纤维粘连蛋白FN 的表达。结果发现，地五养肝胶囊能在一定程度上改善MSG-肝再生-大鼠的肝再生紊乱过程，其作用机制之一可能是通过下丘脑-垂体-肝轴影响神经-内分泌-免疫-肝再生调控网络改善了肝内外肝再生修复的环境［30～32］。

［1］李瀚旻.肝主疏泄与慢性肝病患者的心理调适［J］.中华中医药学刊，2010，28 (7):1349 -1351.

［2］李瀚旻.论“肝主生发”的养生观［J］.中华中医药学刊，2013，31 (10):2085 -2087.

［3］Boros P，Miller GM.HGF:a multifunctional cytokine ［J］.Lancet，1995，345:293 -295.

［4］Michalopoulos GK.Hepatocyte growth factor ［J］.Hepatology，1992，151:149 -155.

［5］Malik R，Selden C，Hodgson H.The role of non-parenchymal cells in live growth ［J］.Semin Cell Dev Biol，2002，13 (6):425 -431.

［6］Kawasaki S，Makuuchi M，Lshizone S，et al.Liver regeneration in recipicnts and donors after transplantation ［J］.Lancet，1992，339:580 -581.

［7］张伟，陈孝平，项帅，等.肝脏胞外基质成分参与卵圆细胞介导的肝再生［J］.中国普通外科杂志，2009，18 (1):58 -62.

［8］Theise ND.Gastrointestinal stem cells.Ⅲ.Emergent themes of liver stem cell biology :niche，quiescence，selfrenewal，and plasticity［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290 (2):189-193.

［9］Snykers S，De Kock J，Rogiers V，et al.In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes:state of the art［J］.Stem Cells，2009，27:577 -605.

［10］Fuchs E，Tumbar T，Guasch G.Socializing with the neighbors:stem cells and their niche ［J］.Cell，2004，116 (19):769 -778.

［11］Martinez-Hernandez A，Amenta PS.The extracellular matrix in hepatic regeneration ［J］.FASEB J，1995，9:1401 -1410.

［12］Zimmermann A.Regulation of liver regeneration ［J］.Nephrol Dial Transplant，2004，19 (Suppl 4):iv6 -10.

［13］Friedman SL.Hepatic fibrosis-overview ［J］.Toxicology，2008，254 (3):120 -129.

［14］Kordes C，Sawitza I，Muller-Marbach A，et al.CD133+hepatic stellate cells are progenitor cells ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，353 (2):410 -417.

［15］Azzarone A，Francavilla A，Carrieri G，et al.Effects on in vivo and in vitro hepatocyte proliferation of methylprednisolone，azathioprine，mycophenolic acid，mizoribine，and prostaglandin E1 ［J］.Transplant Proc，1992，24 (6):2868 -2871.

［16］Starzl TE，Fung J，Tzakis A，et al.Baboon-to-human liver transplantation ［J］.Lancet，1993，341 (8837):65 -71.

［17］Yang SQ，Lin HZ，Yin M，et al.Effects of chronic ethanol consumption on cytokine regulation of liver regeneration ［J］.Am J Physiol，1998，275:G696 -G704.

［18］Sakamoro T，Ezure T，Lunz J，et al.Concanavalin A simultaneously primes liver hematopoietic and epithelial progenitor cells for parallel expansion during liver regeneration after partial hepatectomy in mice［J］.Hepatology，2000，32:256 -267.

［19］曾民德，萧树东.肝脏与内分泌［M］.北京:人民卫生出版社，1997:64 -68.

［20］Taub R.Liver regeneration:from myth to mechanism ［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5 (10):836 -847.

［21］李瀚旻，张六通，梅家俊，等.MSG-肝再生-大鼠模型的建立［J］.世界华人消化杂志，2000，8 (7):824 -826.

［22］李瀚旻，杨木兰，梅家俊，等.MSG-肝再生-大鼠下丘脑神经细胞凋亡及相关基因TGF-β1 的表达［J］.中国应用生理学杂志，2003，19 (1):46 -47，93.

［23］杨木兰，李瀚旻，张六通，等.Dig 标记探针原位杂交检测MSG-肝再生-大鼠下丘脑弓状核TGF-β1 mRNA ［J］.中国组织化学杂志，2002，11 (2):202 -204.

［24］Han-Min Li，Xiang Gao，Mu-Lan Yang，et al.Effects of Zuogui Wan on neurocyte apoptosis and down-regulation TGF-β1 expression in nuclei of arcuate hypothalamus of monosodium glutamate--liver regeneration rats ［J］.World Journal of Gastroenterology，2004，10(19):2823 -2826.

［25］李瀚旻，高翔，周密思.MSG-肝再生-大鼠再生肝组织基因表达谱分析［J］.世界华人消化杂志，2005，13 (4):448 -451.

［26］李瀚旻，杨木兰，梅家俊，等.左归丸对大鼠转化生长因子-α、β 及其受体表达的影响［J］.中华肝脏病杂志，2004，12(5):307 -308.

［27］李瀚旻，张六通，邱幸凡.“肝肾同源于脑”与肝肾本质研究［J］.中医杂志，2000，41 (2):69 -72.

［28］李瀚旻，张六通，邱幸凡，等.左归丸改善MSG-肝再生-大鼠肝肾精血亏虚证的作用机理研究［J］.湖北中医学院学报，2001，3 (4):30 -33.

［29］李瀚旻，高翔，周密思.左归丸对MSG-肝再生-大鼠再生肝组织基因表达谱的影响［J］.中华中医药杂志，2006，21 (2):104 -106.

［30］宋红丽，李瀚旻，林立生，等.地五养肝胶囊对肝肾精虚大鼠肝再生的影响.中西医结合肝病杂志，2013，23 (2):90 -92.

［31］李瀚旻.慢性肝病“肝肾精虚”证的客观量化标准［J］.世界科学技术-中医药现代化，2013，15 (6):1429 -1432.

［32］李瀚旻.“补肾生髓成肝”治疗肝脏病的基础及临床应用［J］.世界科学技术-中医药现代化，2013，15 (6):1425 -1428.