枯草芽孢杆菌生产抗菌物质的食品级发酵培养基优化

沈跃丽，陈 蕊，张 莉，张 充，赵海珍，陆兆新

枯草芽孢杆菌生产抗菌物质的食品级发酵培养基优化

沈跃丽，陈 蕊，张 莉，张 充，赵海珍，陆兆新*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

为得到安全可靠的新型生物防腐剂，用枯草芽孢杆菌发酵食品同时提高其抗菌活性。采用单因素试验和Plackett-Burman试验设计筛选出4 个关键因子为脱脂奶粉、番茄汁、发酵时间和发酵温度；使用Box-Behnken原理设计进行响应面试验确定出最佳培养基配方和发酵条件：小麦粉16.0 g/L、脱脂奶粉20.0 g/L、黄豆粉酶解液200.0 mL/L、番茄汁40.0 mL/L、NaCl 10.0 g/L，装液量50.0 mL、发酵温度32.14 ℃、发酵时间60.0 h。拟合实验模型结果显示：优化后发酵液对荧光假单孢的抑菌圈直径较优化前提高42%，对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径较优化前提高47%。

枯草芽孢杆菌；抗菌活性；发酵；黄豆粉酶解液；优化

全世界每年农副产品、果蔬等食品及其原料变质引起的经济损失十分巨大，因此延长它们的保质期是食品工业的一项重要的任务[1]，而添加防腐剂是防止食品腐败变质的重要方法之一[2]。目前化学防腐剂如添加苯甲酸钠、山梨酸钾等依然在我国防腐剂市场上占很大份额，而化学防腐剂或多或少地对人体会产生一定的毒副作用。随着人民生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念已经越来越多的被大众接受，寻找一种新天然防腐剂以减少化学防腐剂所造成的潜在的危险已成为当今食品保藏研究的热点[3]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，主要是一些有机酸、多肽和前体肽[4]。这些抗菌物质对食品中的多种腐败菌及致病性细菌有较强的抑制和杀灭作用，且易被人、畜体内的蛋白酶降解，从而被人体吸收，不会在体内残留。本课题组在前期研究中得到一株枯草芽孢杆菌PNG27，其产生的抗菌物质具有很广的抑菌谱，对食品中主要的革兰氏阳性菌（短小芽孢杆菌、藤黄微球菌）、革兰氏阴性菌（荧光假单胞菌）和霉菌（米曲霉）都有明显的抑制作用。对微生物的产生的生物防腐剂的研究已经很成熟，且已经工业化生产且应用范围非常广泛，人们将研究的目光逐渐转向用农副产品作为原料进行生产应用的研究，而且已经取得了一系列的进展[5]，这些原料包括乳清粉，以及木薯、土豆等农产品的加工副产物[5-9]。但是到目前为止还没有人用食品级的原料来发酵产抗菌脂肽，用食品级的原料发酵枯草芽孢杆菌产抗菌物质可以做到真正的安全、无毒副作用，可以作为食品添加剂直接加到食品中应用。

本实验旨在利用单因素试验筛选出最优的碳氮源、生长因子和发酵条件，然后利用Plackett-Burman（PB）试验[10-12]设计法对影响枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌肽的影响因子进行筛选，再利用响应面法[13-16]对筛出的关键因子进行优化，从而获得最佳的发酵工艺来提高抗菌物质的抑菌活性。在抑菌活性提高的基础上将其抑菌产物用于食品防腐保鲜的研究，其具有良好的应用前景和开发价值。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PNG27、短小芽孢杆菌CMCC（B）63202、荧光假单胞菌ATCC49642 本实验室保存。

1.1.2 培养基

BPY培养基：牛肉浸膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L， pH 7.0。

NA培养基：牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、琼脂18.0 g/L，pH 7.0。

LB培养基：酵母浸膏5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养

将枯草芽孢杆菌PNG27菌株于37 ℃ NA斜面培养24 h，后以BPY培养基作为种子培养基，从经活化的菌株斜面上转移至BPY培养基中（接种量为两环），37 ℃、180 r/min培养11 h，按照4%的接种量接入发酵培养基中，装液量50 mL/250 mL摇瓶，在33 ℃、180 r/min的条件下振荡培养36 h。

1.2.2 抗菌物质的检测

枯草芽孢杆菌经LB基础培养基33 ℃、36 h发酵，经过5 000 r/min离心20 min去菌体，收集上清，用Ф=0.22 μm的细菌滤膜过滤掉菌体，备用。

本实验在培养基优化过程中采用平板扩散法检测抑菌效果，即用打孔器将4 层滤纸片制成6 mm的圆纸片，放玻璃平皿内包好后于121 ℃、20 min高压蒸汽灭菌后存干燥处备用，使用前用镊子将滤纸片压平。通过测定发酵滤液对荧光假单胞菌（G－，37 ℃、24 h）和短小芽孢杆菌（G＋，30 ℃、18 h）的抑菌圈直径间接反映抗菌物质产量，每个样品重复3 次。

1.2.3 培养基的优化

1.2.3.1 碳氮源的筛选

将15 g/L的小麦粉、玉米粉、玉米淀粉等替代LB培养基中酵母浸膏进行发酵，并以不添加碳源组作为空白组，胰蛋白胨和NaCl添加量不变。随后以最优碳源为基础，分别以10 g/L的维维豆奶、脱脂奶粉和200 mL/L碱性蛋白酶水解黄豆粉作为氮源代替胰蛋白胨作为氮源，并以不添加氮源组作为空白组，NaCl添加量不变（因为需要筛选的是食品级培养基，而LB里的碳源和氮源都不是食品级，没有可比性，所以不添加两者作为对照）。

1.2.3.2 生长因子的筛选

将100 mL/L玉米汁、土豆汁、番茄汁作为生长因子，以前面优化出的培养基作为空白组。

1.2.4 发酵条件的优化

1.2.4.1 不同装液量的影响

在250 mL三角瓶中装液量分别设为50、75、100 mL，发酵温度为33 ℃，发酵时间为36 h以筛选出不同装液量对枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的影响。

1.2.4.2 不同发酵温度的影响

以筛选出来的最适装液量为基础，将培养基分别在28、30、33、37 ℃不同温度下进行培养，发酵时间为36 h，筛选出不同发酵温度对枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的影响。

1.2.4.3 不同发酵时间的影响

以筛选出来的最适装液量和最适发酵温度为基础，将培养基置于24、36、48 h不同发酵时间筛选出不同发酵时间对枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的影响。

1.2.5 PB试验设计

依据前面碳氮源、生长因子及发酵条件的筛选，枯草芽孢杆菌PNG27的发酵培养基的影响因素包括小麦粉、黄豆粉酶解液、脱脂奶粉、番茄汁、NaCl添加量和发酵条件为装液量、发酵时间和发酵温度[3,17-18]。试验设计、数据分析和模型建立都采用软件Design-Expert（Version8.0.5，Stat-Ease Inc），每组试验3 次重复，结果取平均值。

1.2.6 Box-Behnken响应面试验设计

根据PB试验结果中筛选出对荧光假单胞菌和短小芽孢杆菌抑菌活性显著的影响因素，结合因素的效应大小和试验中的实际情况，选择中心点和各水平的步长，各水平及代码。借助试验设计及分析软件Design-Expert（version8.0.5，Stat-Ease Inc.），每组试验重复3 次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 碳氮源的确定

图1 不同碳源对枯草芽孢杆菌PNG27抑菌效果的影响Fig.1 Effect of different carbon sources for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

枯草芽孢杆菌PNG27是本实验以枯草芽孢杆菌BS1为出发菌株经过青霉素钠的诱变筛选出来的菌株。如图1所示，小麦粉、玉米粉、玉米淀粉作为碳源时都比空白组的抑菌效果好。当小麦粉15 g/L为碳源时，荧光假单胞菌抑菌圈直径达到20.41 mm及对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径达到14.99 mm，比玉米粉和玉米淀粉的效果好。小麦粉中含有丰富的营养，特别是淀粉，其是小麦粉的主要营养成分，能够满足菌株所需的碳素营养需求，此外小麦粉还含有丰富的氨基酸和矿物和维生素，来源广泛、成本低廉。因此选择小麦粉作为枯草芽孢杆菌PNG27的碳源。

图2 不同氮源对枯草芽孢杆菌PNG27抑菌效果的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

如图2所示，维维豆奶、脱脂奶粉、黄豆粉酶解液为氮源时，维维豆奶的抑菌效果不如空白组好，但是脱脂奶粉与黄豆粉酶解液作为氮源时其抑菌效果都比空白的效果好。当脱脂奶粉50 g/L和黄豆粉酶解液[19-20]（即是使用碱性蛋白酶水解黄豆粉将其作为氮源，因为此菌不能直接应用黄豆粉）200 mL/L为氮源时其对荧光假单胞菌的抑菌圈直径分别为20.68、19.45 mm及对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为15.97、14.38 mm，抑菌效果较佳，但是考虑到单独使用脱脂奶粉作为氮源时其成本较高，所以使用脱脂奶粉和黄豆粉酶解液作为复合氮源[21]。黄豆粉酶解液含有丰富的多肽类物质和氨基酸，脱脂奶粉除了含有丰富的蛋白质外还含有丰富的矿物质和维生素，两种营养丰富的物质互补以满足菌体不同生长时期的需求，降低培养成本。因此以黄豆粉酶解液200 mL/L和脱脂奶粉10 g/L做为复合氮源，此时发酵液对荧光假单胞菌和短小芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到21.12、16.15 mm，比使用单一氮源效果好。

2.2 生长因子的确定

图3 不同生长因子对枯草芽孢杆菌PNG27抑菌效果的影响Fig.3 Effect of different growth factors for Bacillus subtilis PNG27 on the antibacterial activity of the fermented broth

生长因子是一类微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或是氮源自行合成的有机物。如图3所示，分别添加土豆汁[22]、番茄汁[23]和玉米汁作为生长因子，实验发现三者与空白对荧光假单胞菌的抑菌圈直径没有显著性区别，但是番茄汁对短小芽孢杆菌抑菌圈直径有所提高。在番茄汁添加量为100 mL/L时其对荧光假单胞菌和短小芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到22.33、16.86 mm。番茄汁里含有丰富的VA、VC、VB1、VB2以及胡萝卜素和丰富的金属元素钙、磷、钾、镁、铁、锌、铜和碘等多种元素，还含有蛋白质、糖类、有机酸、纤维素，所以选番茄汁作为生长因子，以提高其抗菌活性。

2.3 发酵条件的确定

2.3.1 装液量的确定

图4 通气量对枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的影响Fig.4 Effect of aeration amount on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

如图4所示，装液量为50 mL时发酵液对荧光假单胞菌抑菌圈直径为22.03 mm及对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径为16.65 mm，比装液量为75、100 mL的效果好，所以选择50 mL的装液量。枯草芽孢杆菌是好养细菌，低的装液量使得液体培养基中溶解氧高，满足菌体生长和代谢的要求，使得产抗菌物质活性提高。

2.3.2 发酵温度的确定

图5 发酵温度对枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的影响Fig.5 Effect of incubation temperature on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

如图5所示，结果表明枯草芽孢杆菌PNG27最适发酵温度为33 ℃，此时发酵液对荧光假单胞菌的抑菌圈直径为22.16 mm，对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径为16.24 mm，温度过高或是过低都不利于菌体的生长和代谢产物的产生，所以选择33 ℃为发酵温度。

2.3.3 发酵时间的确定

如图6所示，培养48 h时发酵液对荧光假单胞菌的抑菌圈直径为22.95 mm及对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径为16.94 mm，抑菌活性最好，其与24、36 h的结果差异显著。适当的延长发酵时间有利于抗菌活性的提高，故在下面的响应面试验中可以适当的把中心点下移。

图6 发酵时间对枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的影响Fig.6 Effect of culture time on the production of antimicrobial substances by Bacillus subtilis PNG27

2.4 枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质重要因素的筛选

选用N=15的PB设计安排，对培养基组分：小麦粉、黄豆粉酶解液、脱脂奶粉、番茄汁、NaCl添加量和发酵条件：装液量、发酵时间和发酵温度共8个因素进行研究，根据前期实验确定各因素的水平。各因素及其代码、编码水平，其中A～E为培养基组分，F～H为发酵条件，响应值为荧光假单胞菌和短小芽孢杆菌抑菌活性的大小。PB试验设计结果和显著性检验如表1～3所示。利用Design-Expert对其结果进行方差分析，对荧光假单胞菌的抑菌圈直径测定结果显示脱脂奶粉（P＜0.000 1）、番茄汁（P＝0.000 2）、发酵时间（P＝0.003 4）、发酵温度（P＜0.000 1），小麦粉（P＝0.021 4），它们在α＝0.05的概率水平上差异显著，其他因子在此水平上不显著。以短小芽孢杆菌作为指示菌进行方差分析结果显示了相似的结果，进一步验证了试验的准确性。其中脱脂奶粉、番茄汁、发酵时间、发酵温度对其产抗菌物质的影响都是极显著的，而小麦粉是有显著的影响，由于影响因子较多就不考虑将小麦粉作为影响因子进行响应面的设计[24]。注：*. 该因子效应显著（P＜0.05）；**. 该因子效应极显著（P＜0.01）。下同。

表1 PB试验设计及枯草芽孢杆菌PNG27抑菌效果Table 1 Plackett-Burman experimental design with actual and predicted values of inhibition zone diameter

表2 荧光假单胞菌PB设计回归模型及其显著性检验Table 2 Regression coefficients and their significance of Placket-Burman design for the inhibitory activity against Pseudomonas flfl uorescens

2.5 响应面试验设计及结果分析

根据PB试验结果和Box-Behnken的试验设计原理[25-26]，做四因素三水平的响应面分析，试验设计及结果如表4所示。

利用Design-Expert软件对表4中的数据进行回归分析，得二次多项式方程：

Y1＝－146.43－0.35C＋0.007 5E＋0.40G＋9.76H－0.003 5CE－0.001 9CG＋0.035CH－0.001 1EG＋0.001 4EH＋0.000 54GH－0.013C2＋0.000 50E2－0.002 5G2－0.16H2

Y2＝－147.02－0.24C＋0.073E＋0.44G＋9.32H－0.007 7CE＋0.003 5CG＋0.017CH－0.000 23EG＋0.02EH－0.004 6GH－0.002 4C2＋0.000 075E2－0.002 8G2－0.15H2

式中：Y1为荧光假单胞菌抑菌圈直径的预测值/mm；Y2为短小芽孢杆菌抑菌圈直径的预测值/mm。

从上述结果来看，本试验所选用的二次多项模型对荧光假单孢和短小芽孢杆菌的抑菌圈直径具有高度的显著性（两者P＜0.000 1），且其失拟项在α＝0.1水平上均不显著，其预测值（R2＝0.942 5）和试验值（R2＝0.943 1）之间有高度的相关性。回归方程显著性检验可以看出，G（两者P＜0.001）、H（两者P＜0.001）、H2（两者P＜0.001）对枯草芽孢杆菌产抗菌物质的曲面效应显著，脱脂奶粉、番茄汁、发酵时间和发酵温度两两之间的交互效应不显著，所以响应面的图不在这里展示。

表4 Box-Behnken设计方案及对荧光假单胞菌和短小芽孢杆菌抑菌圈直径的实际值和预测值Table 4 Box-Behnken experimental design with actual and predicted inhibition zone diameters of Pseudomonas flfl uorescens and Bacillus pumilus

对于模型方程，采用Design-Expert软件进行分析，得出曲面的极值点，对应的发酵条件为脱脂奶粉20.0 g/L、番茄汁40.0 mL/L、发酵时间60.0 h、发酵温度32.14 ℃，此时荧光假单胞菌抑菌圈直径23.24 mm，短小芽孢杆菌抑菌圈直径17.70 mm，为了检测响应面的可靠性，采用上述的条件进行了3 次重复的验证实验，得出荧光假单孢的抑菌圈直径为23.08 mm，短小芽孢杆菌的抑菌圈直径17.22 mm，与预测值都十分相近，说明模型方程与实际情况拟合较好。

3 结 论

微生物的生长和代谢产物的积累会受到培养基成分和发酵条件的影响。为了获得安全可靠的新型生物防腐剂，用安全可靠的食品发酵提高枯草芽孢杆菌生产的抗菌物质的活性，产品可直接用于食品的防腐保鲜中。本实验在前期对培养基成分和发酵条件的优化，然后应用PB试验设计对诸多影响枯草芽孢杆菌产抗菌物质的因子进性评价，筛选出重要的影响因子，省时省力，快速有效。

在PB试验设计的基础上，通过Box-Behnken设计原理进行响应面优化试验对主要影响因子进行优化与评价，获得影响枯草芽孢杆菌PNG27产抗菌物质的拟合数学模型，获得适合枯草芽孢杆菌PNG27的培养基配方和发酵条件：小麦粉15.0 g/L、脱脂奶粉20.0 g/L、黄豆粉酶解液200.0 mL/L、番茄汁40.0 mL/L、NaCl 10.0 g/L，装液量50.0 mL、发酵温度32.14 ℃、发酵时间60.0 h。在此培养基和发酵条件基础上，对荧光假单胞菌的抑菌圈直径比优化前的16.25 mm提高了42%，对短小芽孢杆菌的抑菌圈直径比优化前的11.71 mm提高了47%。

与传统的化学防腐剂相比，微生物防腐剂以安全、天然、无毒副作用的特点而备受人们关注，用微生物防腐剂代替传统的化学防腐剂已成为食品保藏技术的发展趋势[27]。但是目前我国明确批准可以使用的生物防腐剂只有纳他霉素和乳酸链球菌素，品种单一，因此加快新型生物防腐剂的开发和研究是亟需解决的问题。本实验以食品级物质作为枯草芽孢杆菌培养基原料进行研究，为生产食品级的抗菌物质提供了一定的实验依据，其具有良好的应用前景和开发价值。

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Optimization of Food-Grade Medium for the Production of Antibacterial Substances by Bacillus subtilis PNG27

SHEN Yue-li, CHEN Rui, ZHANG Li, ZHANG Chong, ZHAO Hai-zhen, LU Zhao-xin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to obtain safe and reliable new biological preservatives, Bacillus subtilis PNG27 fermented food was used to improve its antibacterial activity. Skim milk powder and tomato juice as well as incubation temperature and time were identified as key medium components and fermentation conditions by one-factor-at-a-time and Plackett-Burman experimental designs. A Box-Behnken response surface methodology was used to determine the optimal medium composition and fermentation conditions as 16.0 g/L wheat flour, 20.0 g/L skim milk powder, 200.0 mL/L soybean meal hydrolysate, 40.0 mL/L tomato juice, 10.0 g/L NaCl, 50.0 mL of medium in a 250-mL triangular flask, and incubation at 32.14 ℃ for 60.0 h. The maximum model-predicted diameter of the inhibition zone of the fermented broth under the optimized conditions was increased by 42% for Pseudomonas fl uorescens and by 47% for Bacillus pumilus compared with those observed before the optimization.

B. subtilis; antibacterial activity; fermentation; soybean flour hydrolysate; optimization

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0168-06

10.7506/spkx1002-6630-201409034

2013-05-15

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD23B05）

沈跃丽（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：2011108027@njau.edu.cn

*通信作者：陆兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向为酶工程和食品生物技术。E-mail：fmb@njau.edu.cn