水酶法提取番木瓜籽油工艺及其氧化稳定性分析

叶丽红，王标诗*，程漪婷，黄日凤，关清好，江 敏，金 蓓，杜建中

水酶法提取番木瓜籽油工艺及其氧化稳定性分析

叶丽红，王标诗*，程漪婷，黄日凤，关清好，江 敏，金 蓓，杜建中

（岭南师范学院化学科学与技术学院，广东 湛江 524048）

以番木瓜籽为原料，通过单因素试验和正交试验研究不同酶种类、酶解时间、料液比、酶添加量、酶解温度等因素对番木瓜籽油提取率的影响，确定番木瓜籽油提取的最佳工艺条件，并以番木瓜籽油过氧化值为评价指标，考察温度、光照、抗氧化剂对番木瓜籽油氧化稳定性的影响。结果表明，番木瓜籽油的最佳提取条件为：选用中性蛋白酶，酶添加量2.5%、酶解时间5 h、料液比1∶7、酶解温度45 ℃。在此条件下，番木瓜籽油的提取率为85.73%。温度、光照、氧气均会引起贮藏过程中番木瓜籽油过氧化值的升高。添加抗氧化剂可明显提高番木瓜籽油的氧化稳定性，其中叔丁基对苯二酚的抗氧化效果最好。

水酶法；番木瓜籽油；提取；氧化稳定性

番木瓜（Carica papaya L.），属番木瓜科、番木瓜属，又名木瓜、万寿果、蓬生果等。番木瓜在世界热带、亚热带地区均有分布。我国主要分布在广东、海南、广西、云南、福建、台湾等省。番木瓜成熟时果肉柔软多汁，味香甜；成熟的番木瓜营养丰富、VC含量高，可助消化、治胃病[1]。番木瓜既可以直接食用，又可以将其加工成果酱和果汁等[2-5]，其含有丰富的木瓜蛋白酶，是生产木瓜蛋白酶的主要原料，在医药、食品、制革、纺织及美容上有着广泛应用[6]。

番木瓜籽是番木瓜加工成产品之后的副产物，工厂往往将其作为垃圾扔掉，这样不仅污染环境，而且浪费了大量的生物资源。据研究报道[6-14]，木瓜籽提取物具有多种生理功能，如木瓜籽的氯仿提取物中存在一种有可逆的天然安全的避孕药物；木瓜籽中含有丰富的三萜类化合物，具有免疫活性；木瓜籽的木瓜籽乙醇提取物具有明显的镇痛、抗感染作用；木瓜籽提取物还具有抗氧化、抗菌、抗癌等活性。因此，研究番木瓜籽及其功能成分有着深远的意义。对番木瓜籽的高值化综合利用，不仅有利于解决环境问题，还将带来良好的经济效益和社会效益。

除了上述成分外，番木瓜籽中还含有丰富的油脂成分[15]。番木瓜籽油属于植物油，其中必需脂肪酸油酸的含量很高，其营养含量指标完全符合食用植物油的要求。番木瓜籽油含有大量的不饱和脂肪酸，在提取和贮存期间不饱和脂肪酸的双键易被氧化，同时脂肪酸组成、双键位置和数量、贮存条件等因素也会影响其氧化稳定性。文献[16-21]报道了有机溶剂法、超临界萃取技术、超声波辅助提取技术等对木瓜籽油的提取效果、木瓜籽油理化性质及影响因素等。而木瓜籽油的水酶法提取工艺文献中未见报道。

本实验主要以番木瓜籽为原料，利用水酶法提取其中的油脂，优化提取工艺条件，并研究光照、温度、抗氧化剂等因素对番木瓜籽油氧化稳定性的影响。此研究的开展可以充分利用番木瓜资源，为番木瓜的深加工和副产物高值化综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番木瓜（九成熟）购于广东湛江市场。

碱性蛋白酶（pH 8.5～10.5，最适温度50～60 ℃，酶活力200 000 U/g）、酸性蛋白酶（pH 2.5～3.5，30～50 ℃，酶活力50 000 U/g）、中性蛋白酶（pH 7.0～7.8，40 ℃，60 000 U/g）、果胶酶（pH 5.5～6，55～60 ℃，酶活力100 000 U/g）、纤维素酶（pH 4～5.5，50～60 ℃，酶活力50 000 U/g） 江苏瑞阳生物科技有限公司；盐酸、NaOH、无水乙醚、石油醚、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、氢氧化钾、乙醇、酚酞等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海精密科学仪器有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；FA2104N型电子精密分析天平 上海济成分析仪器有限公司；SXT-06索式提取器 上海洪纪仪器设备有限公司；80-2电动离心机 金坛市新航仪器厂；HZSHA水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；C型玻璃仪器气流烘干器 长城科工贸有限公司；QN-999粉碎机 江苏金坛市环宇科技仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 番木瓜籽含油率的测定

原料预处理：用水将番木瓜籽表面的浆状物质洗掉，然后用手和布搓掉包裹番木瓜籽的胶状物质，稍微晾干放入烘箱60 ℃恒温烘5～10 h ；用粉碎机粉碎番木瓜籽，使番木瓜籽内部的含油物质破碎，得到粉末状的番木瓜籽粉。

以无水乙醚和石油醚为抽提剂，用索氏抽提法提取番木瓜籽油，按式（1）计算番木瓜籽油含油率。

1.3.2 番木瓜籽油水酶法提取工艺

准确称取经清理、干燥、粉碎后的番木瓜籽粉3 g于 200 mL锥形瓶中，加水15 mL，混匀后90 ℃水浴10 min灭酶，冷却至室温后调pH值（用磷酸盐缓冲溶液调节），加酶，置于恒温振荡器中，在设定的酶解温度及酶解时间条件下进行酶解，反应完成后90 ℃水浴10 min灭酶，3 500 r/min离心30 min，收集残渣测定残渣含油量及按式（2）计算番木瓜籽油提取率[22]。

1.3.3 单因素试验

称取一定量烘干的粉末状番木瓜籽若干份，分别进行酶种类及添加量、酶解时间、酶解温度、料液比等单因素试验，以油脂提取率为指标，考察不同因素对番木瓜籽油脂提取的影响。

1.3.3.1 酶种类对番木瓜籽油提取率的影响

分别在每种酶的最适pH值、最适温度条件下，酶添加量2.00%，料液比选1∶5（g/mL），置于恒温水浴振荡器中在110 r/min的转速下酶解6 h，3 500 r/min离心30 min，考察碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶及果胶酶对番木瓜籽油提取率的影响。

1.3.3.2 酶解时间对番木瓜籽油提取率的影响

取2 g番木瓜籽粉末若干份于50 mL锥形瓶中，加水18 mL，混匀后90 ℃水浴10 min灭酶，降至室温后调pH值，加酶，酶添加量1.00%，置于冷冻恒温振荡器中，测定在该酶最适酶解解温度的条件下，酶解时间（1、2、3、4、5、6、7 h）对番木瓜籽油提取率的影响。

1.3.3.3 料液比对番木瓜籽油提取率的影响

取2 g番木瓜籽粉末若干份，分别加入不同量烧开的蒸馏水进行灭酶，混匀后90 ℃水浴10 min灭酶，降至室温后调pH值，加酶，在酶添加量1.00%、最适酶解温度的条件下，测定不同料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）对番木瓜籽油提取率的影响。

1.3.3.4 酶添加量对番木瓜籽油提取率的影响

取2 g番木瓜籽粉末若干份于50 mL锥形瓶中，加水18 mL，混匀后90 ℃水浴10 min灭酶，降至室温后调pH值，加酶，置于冷冻恒温振荡器中，测定在该酶最适酶解温度、酶解5 h的条件下，酶添加量（0.5%、1.0%、1.5% 、2.0%、2.5%）对番木瓜籽油提取率的影响。

1.3.3.5 酶解温度对番木瓜籽油提取率的影响

取2 g番木瓜籽粉末若干份于50 mL锥形瓶中，加水18 mL，混匀后90 ℃水浴10 min灭酶，降至室温后调pH值，测定在酶添加量1.00 %、酶解时间5 h条件下，酶解温度（35、40、45、50、55、60、65 ℃）对番木瓜籽油提取率的影响。

1.3.4 正交试验

采用正交试验设计，应用L9（34）正交表，以单因素试验为基础，选择酶解时间、料液比、酶添加量和酶解温度为因素，进行四因素三水平正交试验，正交试验因素及水平见表1。以油脂提取率为指标，得出提取番木瓜籽油的最佳条件。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.5 番木瓜籽油酸值、皂化值、过氧化值的测定

酸值的测定：采用GB/T 5530—2005《动植物油脂酸值测定》；皂化值的测定：采用GB/T 5534—2008《动植物油脂皂化值的测定》；过氧化值的测定：采用GB/T 5538—1995《动植物油脂过氧化值测定》。

1.3.6 不同因素对番木瓜籽油氧化稳定性的影响[23]

分别取15 g番木瓜籽油置于50 mL广口瓶中，在2 ℃、室温、60 ℃不同条件下以及在自然光和室温避光条件下存放，24 h搅拌1 次，测定番木瓜籽油的过氧化值，研究温度和光照对番木瓜籽油稳定性的影响。

采用Schaal烘箱加速法，选择叔丁基对苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）2 种抗氧化剂，分别配制成抗氧化剂质量分数为0.01%的油样，混合均匀，密封置于（60±1）℃的恒温箱中，以不添加抗氧化剂的番木瓜籽油为对照，24 h搅拌1 次，测定番木瓜籽油的过氧化值（peroxide value，POV），研究其对番木瓜籽油的抗氧化效果。

1.4 数据处理

实验均平行3 次，结果以均值±标准偏差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 番木瓜籽含油率的测定结果

通过索氏提取法，以乙醚作提取溶剂时，番木瓜籽含油率为（32.30±0.35）%，以石油醚作提取溶剂时，番木瓜籽含油率为（32.05±0.42）%。邓楚津等[24]研究表明，番木瓜籽中粗蛋白含量24.91%，粗脂含量32.21%。这与本实验的测定结果比较接近。

2.2 番木瓜籽油水酶法提取工艺条件优化

2.2.1 酶种类对番木瓜籽油提取率的影响

由图1可知，酶的添加能显著提高番木瓜籽油的提取率，在相同的条件下，作用最显著的是中性蛋白酶，提取率达73.9%，说明中性蛋白酶能使番木瓜籽内的蛋白质很好地分解，释放出游离油脂。所以确定水酶法提取番木瓜籽油的最适酶种类为中性蛋白酶。

图1 酶种类对番木瓜籽油提取率的影响Fig.1 Effect of enzyme type on the extraction yield of papaya seed oil

2.2.2 酶解时间对番木瓜籽油提取率的影响

图2 酶解时间对番木瓜籽油提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of papaya seed oil

由图2可以看出，在前5 h内，随着中性蛋白酶作用时间的延长，提取率明显增加，当酶解反应5 h时，提取率最高为85.5%；继续延长酶解时间，提取率变化不大。考虑到随着酶解时间的延长，获得番木瓜籽油的品质会逐渐下降，且生产周期越长，能量消耗越大，继而影响生产成本。综合考虑可知最佳酶解时间为5 h。

2.2.3 料液比对番木瓜籽油提取率的影响

图3 料液比对番木瓜籽油提取率的影响Fig.3 Effect of substrate to water ratio on the extraction yield of papaya seed oil

从图3可以看出，开始时随着提取液体用量的增大，提取率几乎呈直线上升，当料液比在1∶6后提取率呈下降趋势。当料液比为1∶6时，番木瓜籽油提取率高达80.3%，因为此时底物质量浓度和酶质量浓度达到合适的比例，反应速率加快，油脂提取率也随之增加，这说明水酶法提取油脂时适量的水对提油是有利的。但是当底物质量浓度继续降低，酶与底物的接触减少，这样酶的作用效果就会降低，从而导致提取率下降。因此，最佳料液比为1∶6。

2.2.4 酶添加量对番木瓜籽油提取率的影响

图4 酶添加量对番木瓜籽油提取率的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on the extraction yield of papaya seed oil

由图4可知，酶添加量从0.5%增加到1.5%时，其提取率显著增加，随后继续添加中性蛋白酶，提取率缓慢下降并趋于平衡。可见酶添加量过少不能够完全作用于番木瓜籽，当酶添加量达到1.5%时，已能较好地酶解番木瓜籽释放油脂，继续添加酶其提取率缓慢降低。这是因为过多的酶会吸附在番木瓜籽表面，使得油脂被包裹在其中无法释出。因此，综合考虑提取率及试验成本等多方面的因素，酶最佳用量稳定在1.5%。

2.2.5 酶解温度对番木瓜籽油提取率的影响

图5 酶解温度对番木瓜籽油提取率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the extraction yield of papaya seed oil

从图5以看出，当酶解温度为35～50 ℃时，番木瓜籽油的提取率随酶解温度的上升而逐渐增加；50～65 ℃时，提取率随酶解温度的上升而逐渐下降；50 ℃为酶水解反应的最适宜温度，该温度条件下，番木瓜籽油的提取率为83.7%。这主要是因为各种酶都有最适宜的作用温度，在最适温度条件下，反应物的能量增加，单位时间内各组分之间有效接触的次数增多，反应速度加快；若反应体系的温度高于酶作用的最适宜温度，酶分子吸收过多的能量，引起维持酶分子结构的次级键解体，导致酶蛋白变性，因此使酶活性减弱，降低了提取率。因此，最佳酶解温度为50 ℃。

2.2.6 正交试验结果

在单因素试验基础上，以酶解时间（A）、料液比（B）、酶添加量（C）、酶解温度（D）为考察因素，番木瓜籽油提取率为考察指标进行L9（34）正交试验。正交试验结果见表2。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Results of orthogonal array design

由表2可以看出, 在水酶法提取番木瓜籽油过程中，影响番木瓜籽油提取率的因素主次顺序为C＞B＞A＞D，最佳组合为A2B2C3D1。全面考虑经济、提取率及操作的方便性等因素选取最优条件为A2B2C3D1，即酶解时间5 h、料液比1∶7、酶添加量2.5%、酶解温度45 ℃，在此条件下番木瓜籽油提取率为（85.73±0.86）%。在该条件下做验证实验，番木瓜籽油提取率为（85.73±0.52）%。说明此结果可靠性强。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance for the results of orthogonal array design

由表3方差分析可知，在水酶法提取番木瓜籽油工艺正交试验所选择的因素和水平范围内，A、B、C、D因素的影响均未达到显著性水平（P＜0.05），即酶解时间、料液比、加酶量和酶解温度对番木瓜籽油的提取影响均不显著，而F值结果表明方差分析结果与直观分析结果一致。

2.3 番木瓜籽油酸价、过氧化值和皂化值的测定结果

利用最佳方案提取出番木瓜籽油，用国标法测出其酸值为0.012 mg KOH/g，皂化值为158.53 mg/g，过氧化值为1.23 meq/kg。由此可见，提取的番木瓜籽油的酸值、皂化值、过氧化值都符合国家食用油标准，无明显的氧化酸败，这充分说明原料的品质良好。刘书成等[16]以正己烷为溶剂提取番木瓜籽油，其酸值和过氧化值指标都达到食用油的标准，这与本实验的结果基本一致。

2.4 番木瓜籽油的氧化稳定性

2.4.1 温度对番木瓜籽油稳定性的影响

图6 温度对番木瓜籽油稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on the stability of papaya seed oil

由图6可知，在各温度条件下放置10 d，番木瓜籽油的过氧化值均呈上升趋势，且温度越高，过氧化值增加幅度越大，这说明番木瓜籽油在贮藏过程中自动氧化始终没有停止，而且其自动氧化程度与温度和时间成正相关，在相同的时间条件下，温度越高过氧化值越高。在测试前各个样品的过氧化值仅为1.23 meq/kg，处理10 d后，在60 ℃条件下的番木瓜籽油过氧化值变化幅度最大，而在2 ℃条件下的番木瓜籽油过氧化值变化幅度不大。因此低温有利于番木瓜籽油的贮藏，延缓油脂的自动氧化。

2.4.2 光照对番木瓜籽油稳定性的影响

图7 光照对番木瓜籽油稳定性的影响Fig.7 Effect of light on the stability of papaya seed oil

油脂氧化有自动氧化和光氧化两种。自动氧化是指空气中的氧与油脂的氧化过程，其中最经典的是游离基反应，而在光照条件下，光氧化和自动氧化都可以进行，且在自动氧化初期，光氧化是关键的诱因。因为光能促进过氧化物的分解，还能引发游离基，促进氧化反应的进行。由图7可知，番木瓜籽油的过氧化值随着处理时间的延长而升高，避光存放的番木瓜籽油的氧化速度明显低于自然光照射，说明光可使氧分子活化加快番木瓜籽油的氧化。因此，番木瓜籽油适宜采取避光保存。

2.4.3 抗氧化剂对番木瓜籽油的稳定性的影响

不饱和脂肪酸极易发生自动氧化和分解，直接影响着油脂的氧化稳定性。由图8可知，添加 TBHQ、BHT抗氧化剂可很好的提高其抗氧化性，在高温条件下处理10 d，其过氧化值仍然保持在较低的水平。由此说明抗氧化剂对番木瓜籽油均能起到有效的抗氧化效果，而且TBHQ的抗氧化效果比BHT好很多。该结果与陈元平等[25]报道基本一致，说明TBHQ对油脂的抗氧化效果显著。

图8 抗氧化剂对番木瓜籽油的稳定性的影响Fig.8 Effect of antioxidants on the stability of papaya seed oil

3 结 论

采用不同酶提取番木瓜籽油，发现中性蛋白酶最有利于蛋白降解和油脂的提取，并考察了酶解时间、料液比、酶添加量、酶解温度等对油脂提取率和蛋白水解度的影响，用正交试验优化法确定了水酶法提油的最佳条件为酶解温度45 ℃、料液比1∶7、酶添加量2.5%，在此条件下酶水解5 h，番木瓜籽油提取率达到85.73%。

温度、光照、氧气均会引起贮藏过程中番木瓜籽油过氧化值的升高。其中光照比温度对番木瓜籽油过氧化值的影响更加明显。因此，贮藏番木瓜籽油时，应将其放置于密闭容器中，存放在阴凉、避光处。添加抗氧化剂可明显提高番木瓜籽油的氧化稳定性，其中TBHQ的抗氧化效果最好。

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Aqueous Enzymatic Extraction and Oxidative Stability of Papaya Seed Oil

YE Li-hong, WANG Biao-shi*, CHENG Yi-ting, HUANG Ri-feng, GUAN Qing-hao, JIANG Min, JIN Bei, DU Jian-zhong
(School of Chemistry Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China)

This study was aimed to establish the optimum conditions for the aqueous enzymatic extraction of papaya seed oil by investigating the effects of enzymes, hydrolysis time, substrate to water ratio, enzyme dosage and temperature on oil yield by using single-factor and orthogonal array designs. Meanwhile, the effects of temperature, light and antioxidants on the oxidative stability of papaya seed oil as reflected by its peroxide value were also analyzed. The results showed that the optimum parameters for extracting papaya seed oil were found to be 5 h of hydrolysis using neutral protease at a dosage of 2.5% with a substrate to water ratio of 1:7 (g/mL) at 45 ℃. Under the optimized conditions, the extraction yield of papaya seeds oil was 85.73%. Temperature, light and oxygen caused an increase in peroxide value during storage of papaya seed oil and TBHQ had good antioxidant effect on the oil.

aqueous enzymatic method; papaya seed oil; extraction; oxidative stability

TS221

A

1002-6630（2014）16-0058-06

10.7506/spkx1002-6630-201416011

2013-11-21

广东省高校优秀青年创新人才培养计划项目（2012LYM_0091）；2013年广东省大学生创新创业训练计划项目

叶丽红（1990—），女，本科生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：hang_kong2002@163.com

*通信作者：王标诗（1980—），男，讲师，博士，研究方向为食品化学、食品加工及安全。E-mail：hang_kong2002@163.com