台兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

王朝雯，王云艳，肖春宏，孙小琴，杨柏云

(1.临沧师范高等专科学校数理系，云南临沧677000;2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌330031)

台兰(Cymbidium floribundum var.pumilum)又名蜜蜂兰、蜂子兰、金棱边、蒲兰等，为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年半地生性兰科植物。兰花的种质资源是选种育种的基础，种质资源一旦灭绝，无法再造，从这一意义上来说，野生兰花若再不加以保护，将会对世界兰花的育种、研究造成不可弥补的损失，并将会直接威胁到我国兰花经济的持续发展。目前，关于兰科植物的研究主要集中在形态学、分类学、生理学、孢粉学、区系地理学和繁殖生物学等方面［1－2］，而关于居群遗传学的研究则很少。

近年来，应用ISSR-PCR分子标记技术对植物进行遗传多样性研究已有较多报道［3－5］，而采用ISSR技术对野生台兰的遗传多样性和居群遗传结构进行的研究鲜有报道。笔者以采自江西省赣州市齐云山的台兰作为试验材料，对台兰ISSR-PCR反应体系进行优化，以建立比较完善的反应条件，以期为建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行台兰遗传多样性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 试验样品采自江西省赣州市齐云山的一个自然居群，每个居群采集15～20个样本。记录采集样品的经纬度、海拔和生境，同时对每个居群采集凭证标本供研究用。采集完成后用硅胶干燥法进行处理、保存，备用。

1.2 基因组DNA的提取 采用改良的CTAB法提取台兰基因组DNA，步骤如下:①取0.05 g硅胶干燥的台兰叶片材料，置于1.5 ml离心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75ml 65 ℃预热的2×CTAB 抽提缓冲液(pH8.0)，20μlβ-硫基乙醇，轻轻摇动使溶液分散均匀，65℃水浴1 h，水浴过程每隔10 min轻轻摇动。②冷却至室温，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合均匀，12 000 r/min离心10 min。③吸取上层液相转入新的1.5 ml离心管，加等体积氯仿异戊醇，摇匀。④12 000 r/min离心10min。取上层液相，加1/10体积3mol/L的冰醋酸钠，2倍体积－20℃的无水乙醇，－20℃保存20 min。⑤勾出DNA。⑥加70%乙醇洗涤2次，用无水乙醇洗涤1次，风干。⑦用40μl 0.1TE溶解 DNA，－20℃长期保存备用。

1.3 DNA样品的检测 用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度，DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算，浓度估算法为:DNA浓度(ng/μl)=OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率(DNA量/所用叶片量×100%)为1.8%。

1.4 ISSR-PCR 扩增反应

1.4.1 ISSR-PCR 条件筛选。反应体系为25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物浓度为 0.4 μmol/L，双蒸水 15.78 μl。为确定PCR反应中其他4项因素(DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs)的最佳水平，试验用引物对ISSR-PCR反应的这4项影响因素逐个进行5个水平的研究，各反应参数变化量见表1。反应总体积为25μl(含2.5μl10×buffer和15.78 μl ddH2O)。

表1 ISSR-PCR反应体系各成分优化试验设计

1.4.2 ISSR引物筛选。ISSR引物根据加拿大British Columbia大学公布的序列设计，由上海生物工程技术服务有限公司合成，编号为UBC 808～UBC ISSR22，共96条引物。每次试验选择Tm值接近的12个引物，具体见表2。

表2 ISSR引物及其序列

1.4.3 PCR 扩增步骤及参数。取1.5 ml已灭菌 eppendorf管，依扩增的样本数计算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs→Taq酶，混匀后分装到各扩增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入PCR扩增仪样本中，按以下程序进行扩增。扩增完毕，将样本取出，置于4℃ 冰箱保存，等待电泳。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共40个循环;72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收纯化目的条带。

1.5 电泳与拍照 PCR扩增结束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus(上海生物工程公司产品SM0321)为分子量标记，用含有0.1%EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳(0.6 g琼脂糖，40ml1×TAE缓冲液)，电泳缓冲液为1×TAE电泳缓冲液100 V稳压100mA电泳45～60min，凝胶成像仪下成像拍照并保存。

2 结果与分析

2.1 Taq DNA聚合酶对 ISSR-PCR反应的影响 试验设计了 Taq DNA 聚合酶5 个浓度梯度为0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同时对 5 个引物 18291、18294、18295、18297 和18298进行筛选。图1表明，当Taq DNA聚合酶浓度为0.18和0.20 U 时，扩增谱带模糊不清;浓度为 0.20、0.25、0.28 U时，扩增谱带较弱，且数量相对较少;浓度为0.22 U时扩增条带较多且较亮，效果最好，故确定为最佳浓度。同时可以看出引物18257和18297的条带较为清晰而且数量较多，筛选出效果较好的引物为18257和18297。

图1 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

2.2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响 图2表明，当浓度为0.3 mmol/L时，几乎无扩增产物;在0.4 mmol/L时，虽有扩增产物，但谱带较弱不易辨认;浓度为0.5～0.7 mmol/L时，均能扩增出清晰的谱带，但在0.6～0.7 mmol/L，扩增产物不稳定且有非特异性扩增;在0.6 mmol/L时，扩增谱带较弱或一些大的片段扩增缺失。考虑到结果的稳定性和减少试验成本，选用0.5 mmol/L的dNTPs浓度，在此浓度下，扩增产物稳定、重复性强。同时对引物18262、18265、18266、18268和18269进行筛选，得出18265和18269扩增效果较好。

2.3 M g2+浓度对 ISSR-PCR反应的影响 图3表明，Mg2+浓度对反应体系影响不是很明显，除浓度为2.0 mmol/L时扩增条带稍亮些以外，其他浓度电泳出的条带数目及清晰度基本类似。由此可见，台兰基因组DNA的ISSR扩增反应对Mg2+浓度不敏感，Mg2+含量许可范围较大，但考虑到结果的稳定性和可重复性，选用2.0mmol/L为最佳浓度，同时筛选出较好的引物为18264和18267。

图3 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响

2.4 模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响 图4表明，模板DNA浓度对台兰ISSR-PCR扩增效果有一定的影响。台兰ISSR反应对模板DNA浓度不甚敏感，模板含量许可范围较大。在25μl反应体系中，除了浓度400 ng几乎没有扩增条带，浓度在40～200 ng均能获得比较清晰的谱带，但在100 ng时扩增出的条带最多且清晰，又考虑到结果的稳定性和可重复性，因此选用100 ng作为适宜的模板浓度。同时对引物18249、18270、18315、18320 和18333 进行筛选，选出效果较好的引物为18249和18315。

图2 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

2.5 台兰优化体系的建立 通过对以上各种影响因素的分析优化，建立了反应稳定、重复性好的台兰ISSR-PCR反应体系:在25 μl反应体系中含 2.5 μl 10 ×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0mmol/LMgCl2，0.4 μmol/L 引物，0.22 U Taq DNA聚合酶，100 ng模板DNA，双蒸水15.78μl。PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30 s，50～60℃退火(退火温度随引物不同而定，根据各引物的Tm值略低1～2℃)30 s，72℃延伸50 s，40个循环;72℃延伸7 min，4℃保存。

为了检测优化的效果，试验利用建立的优化体系，选用UBC822引物，在复性温度为50℃条件下，对12个筛选的引物进行批量扩增。图5表明，优化后的反应体系是比较理想的。

3 结论与讨论

3.1 ISSR反应体系主要成分对ISSR-PCR反应稳定性的影响 ISSR是基于PCR反应的一种分子标记技术，具有DNA用量少、操作简单、快速灵敏、成本低等优点［6］，但ISSRPCR扩增反应容易受许多因素的影响，如:Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度、dNTPs用量、DNA模板的浓度和纯度等，而且这些因素之间存在相互作用。因此，不同物种的最佳扩增条件各有不同，为确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，获得较高的ISSR-PCR扩增谱带，提高分析的准确性，针对不同物种相应的反应体系中各种影响因子进行优化，筛选出最适宜的ISSR-PCR扩增反应条件非常重要。

图4 模版DNA浓度对ISSR扩增的影响

图5 引物UBC822的扩增结果

在ISSR-PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶的用量直接决定着实验的成功与否，量多不仅增加试验成本而且容易产生非特异性扩增产物;量少则会使酶过早地消耗完，产物合成效率低［7］。试验中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U时条带数量少且比较暗，用量多于0.22 U时条带虽然没有减少，但是出现了非特异性扩增产物，结果表明0.22 U是台兰ISSR-PCR反应的最佳条件。

dNTPs是ISSR-PCR反应的原料，通常dNTPs浓度范围为 0.02 ～0.20mmol/L［8］。dNTPs为 Taq DNA 聚合酶提供底物，使产物得以延伸。当dNTPs浓度过高，则导致Taq DNA聚合酶的错误掺入，会导致PCR错配，从而使扩增出现非特异性扩增，影响扩增的准确性;浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因过早的消耗而使产物单链化，影响扩增效果［9］。试验中dNTPs浓度为0.3和0.4 mmol/L时，因浓度太低而扩增产物过少，浓度为0.5、0.6 和0.7mmol/L 时都有较多扩增产物，但后两者非特异性扩增相对较多，结果表明0.5 mmol/L为dNTPs最佳浓度。

Mg2+浓度是影响ISSR-PCR结果的一个重要因素，Mg2+浓度不仅影响Taq酶的活性［10］，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物结合，影响引物与模板的合效率、模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成［11］。试验中Mg2+浓度对反应无明显影响，所设置的几个浓度都有较多扩增产物，但浓度为2.0 mmol/L时条带较亮，结果表明2.0mmol/L为Mg2+最佳浓度。

DNA模板浓度也是影响ISSR-PCR扩增效果的因素之一，浓度过低，扩增产物不稳定或无扩增产物;浓度过高，又会相应增加非特异性产物的扩增。最佳的模板浓度范围取决于研究的物种和模板纯度，在DNA模板不纯的情况下，宁可使用有效浓度范围内的最低浓度，使抑制Taq DNA聚合酶的影响降到最小。试验中随着DNA模板浓度升高，扩增产物也相应增加，但同时非特异性产物也在增加，因此，考虑到稳定性和节约成本，试验采用的最佳DNA模板浓度为100 ng/L。

3.2 扩增程序对ISSR-PCR反应稳定性的影响 PCR程序设计中，重要的是复性温度的制定，引物的退火温度也极大地影响着ISSR反应的进行，由于引物碱基序列长短不同使得引物的退火温度也不尽相同。即使同一引物，在不同的植物样品中的退火温度也不一样。在同一PCR反应系统中，退火温度不同，产生错配的程度也不同，通常较低的温度在保证引物与模板结合稳定性的同时，也会使引物与模板之间为完全配对的一些位点间得到扩增，即产生一定的错误扩增［12］。因此，在允许的范围内，选择较高的退火温度可减少引物与模板之间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性［13］。通过试验表明复性温度最好比引物TM值略低1～2℃，这个温度复性效果比较好。

PCR循环数对扩增产物量有明显的影响，选择适宜的循环次数将会获得良好的扩增图谱。从理论上说，循环次数少，产物量少;循环次数越多，扩增产物产率越高。但实际上，次数太多，达到反应平台后，循环不会使产物明显增加，反而引起非特异性扩增［14］。

［1］罗毅波，王春玲.中国兰科植物保育现状和展望［J］.植物多样性，2003，11(1):70-77.

［2］CHRN SC，LUO Y B.Advances in some plant groups in China.I.A retrospect and prospect of Orchidology in China［J］.Acta Botanica Sinica，2003，45(S1):2-20.

［3］杨玉玲，马祥庆，张木清.ISSR分子标记及其在树木遗传育种研究中的应用［J］.亚热带农业研究，2006，2(1):18-24.

［4］张立荣，徐大庆，刘大群.SSR和ISSR分子标记及其在植物遗传育种研究中的应用［J］.河北农业大学学报，2002，25(1):90-94.

［5］王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用［J］.遗传，2002，24(5):613-616.

［6］陈业，张玉晶.兜兰属植物ISSR-PCR反应体系的优化［J］.山地农业生物学报，2012，31(4):297-300.

［7］周俊亚，宾晓芸，彭云滔，等.罗汉果ISSR-PCR反应体系的建立［J］.广西师范大学学报:自然科学版，2004，22(3):81-84.

［8］邹喻萍，葛送，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京:科学出版社，2001.

［9］卢圣栋.现代分子生物学技术［M］.2版.北京:中国协和医科大学出版社，1999:458-463.

［10］余艳，陈海山，葛学军.简单重复序列区间ISSR引物反应条件优化与筛选［J］.亚热带热带植物学报，2003，1(1):15-19.

［11］高丽，杨波.春兰ISSR-PCR反应体系的优化［J］.华中农业大学学报，2006，6(3):305-309.

［12］冯夏莲，何承忠，张志毅，等.毛白杨 ISSR反应体系的建立及优化［J］.北京林业大学学报，2006，28(3):61-65.

［13］LU SD.Current protocols formolecular biology［M］.2nd ed.Beijing:Peking Union Medical College Press，1999:458-463.

［14］张志红，谈月笑，何航航，等.红树植物海漆 ISSR条件的优化［J］.中山大学学报:自然科学版，2004，43(2):63-66.