丁岙杨梅挥发油成分及抗肿瘤活性的研究

刘 涛，金吉林，金吉芬，彭志军，罗福贤

贵州省农业科学院果树科学研究所，贵阳 550006

杨梅(Myricarubra Sieb.et Zucc)为杨梅科杨梅属亚热带常绿果树，原产我国东南部，以浙江、江苏、福建等省为主要产区［1-4］。杨梅果鲜汁旺、风味独特、营养丰富［5，6］。作为我国的传统特产水果，杨梅色泽鲜艳、汁液多，营养价值高，风味独特，能生津解渴，助消化，浸酒。中医认为，杨梅性温味甘酸，具有生津止渴、和胃调食、行气止痛的功效［5］。《本草纲目》中记载:“杨梅味酸甜，性温、无毒。能止渴、和五脏、涤肠胃，除烦溃恶气”［7］。《开宝本草》中记载:杨梅“主去痰、止呕、断下痢，清食解酒”［3］。果实中主要含有葡萄糖、果糖、维生素﹑蛋白质、柠檬酸等［8］，杨梅中的微量营养元素主要包括花青素和多酚类，这两类物质对于杨梅的营养、感官、生物活性、商业价值均具有重要的意义，其中多酚类化合物主要有:对羟基苯甲酸类(食子酸、原儿茶酸等)、黄酮类(槲皮素、杨梅黄酮等)、鞣质(水解鞣质、缩合鞣质)等［9］。在温州市茶山镇大罗山上，满山是清一色的杨梅树，称茶山“丁岙梅”。王贤亲等采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对丁岙杨梅叶的挥发油化学成分进行了分析［10］，而目前对于丁岙杨梅果实挥发油化学成分的研究尚未见报道。本文以水蒸气蒸馏法提取其挥发性成分，采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对其化学成分进行分析鉴定，同时研究了丁岙杨梅挥发油的抗肿瘤生物活性，为其质量全面评价提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

丁岙杨梅果实由贵州省荔波县甲良杨梅基地提供，于2013年6 月采摘同株树上成熟度一致的果实，剔除烂果。RPMI 1640 培养基(美国GIBICO 公司);胰蛋白酶(美国SIGMA 公司);胎牛血清(天津市灏阳生物制品科技有限公司);MTT(北京鼎国生物技术发展有限公司);SDS(北京鼎国生物技术发展有限公司)。

1.2 仪器与设备

ISQ 型气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo 公司);YXQ-LS-50 灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);XW-80A 旋涡混合器(上海精科实业有限公司);CO2培养箱(日本SANYO 公司)。

1.3 供试细胞

胃癌细胞株MGC-803、乳腺癌细胞株MCF-7 以及肺癌细胞株A549 购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取

将新鲜的丁岙杨梅去皮及其籽，阴凉处风干后，粉碎。将粉末35 g 放入1 L 烧瓶中，加水200 mL 和数粒玻璃珠，连接挥发油测定器和回流冷凝管，在电热套中进行提取，等沸腾后保持微沸4 h，直至挥发油不再增加为止。提取结束后，将挥发油提取器下端的水相除去，收集黄色油层，再用无水硫酸钠干燥备用。

2.2 气相色谱条件

气象色谱HP-5 MS 5% phenyl Methyl Siloxane(0.25 μm×0.25 mm×30 m)弹性石英毛细管柱，柱温以50 ℃起并以5 ℃/min 升温到280 ℃，保持10 min;汽化室温度为250 ℃，载气为高纯 He(99.999%)，载气流量为1.5 mL/min，进样量为1 μL(用将样品稀释的溶液)，不分流。

2.3 质谱条件

离子源为EI 源，离子源温度为280 ℃，电子能量是70 eV，接口温度为280 ℃，溶剂延迟2 min，质量范围m/z 40～550。所得质谱图通过HPMSD 化学工作站，结合Nist 5 标准质谱图库，根据有关文献进行人工检索解析鉴定样品中化学成分的质量分数，结果见表1。

2.4 抗肿瘤活性测试

将96 孔板的上、下行用灭菌二次水封边，每孔200 μL。取对数生长期细胞，胰酶消化后，重悬于含10% FBS 的RPMI 1640 培养基中，以2 ×104cells/mL 的终浓度接种于96 孔培养板，每孔100 μL，最右侧一列为空白对照组，加无细胞的有血清RPMI 1640 培养基。置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养24 h 使细胞贴壁。吸掉培养基，加入含不同药物浓度的有血清培养基，每孔200 μL，注意培养基中DMSO 终浓度不能超过0.1%，空白对照组每孔加200 μL 完全培养基。分别处理实验要求时间，去除上清，加100 μL/well 浓度0.5 mg/mL 的MTT。培养4 h 后再补加100 μL/well 的10% 的SDS。37 ℃下10 h 使结晶物充分溶解后取出，微震荡5 min，放置室温下30 min，在A595波长下测OD值，并计算细胞活性、抑制率和P 值［11-13］。以药物浓度或处理时间为横轴，OD 值或者抑制率为纵轴，绘制曲线。每样本浓度重复六个孔，每个实验重复三次，取平均值为最终结果。实验结果以SPSS 软件进行方差分析，P＜0.05 时为差异显著，P＜0.01 时为差异极显著，实验结果如图1 所示。细胞增殖的抑制率计算公式如下:

表1 丁岙杨梅果实挥发油的成分及相对含量Table 1 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in M.rubra

图1 丁岙杨梅果实挥发油对肿瘤细胞抑制率Fig.1 The inhibitory effects of volatile oil on different tumor cell lines in vitro

3 讨论

本文使用水蒸气蒸馏法从丁岙杨梅果实中提取挥发油，通过气相色谱-质谱联用方法对其进行化学成分分析。如图1 所示，从丁岙杨梅果实挥发油中分离得到33 个峰，鉴定出了其中的27 个化合物，已鉴定的化合物占总组分的92.37%，其主要成分为:石竹烯(20.80%)、邻苯二甲酸己烷-3-醇异丁醇酯(9.73%)、棕榈酸(26.55%)、2，2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(6.55%)、邻苯二甲酸二异辛酯(4.23%)、β-谷甾醇(3.23%)等。本文与文献［10］分析得出的丁岙杨梅叶挥发油化学成分有较大差异，丁岙杨梅叶的主要化学成分为石竹烯(49.79%)、α-石竹烯(24.16%)、橙花叔醇(16.59%)、石竹烯氧化物(2.21%)等。可见，丁岙杨梅果实及其叶挥发油的主要化学成分除石竹烯外其它化学成分的鉴定结果不尽相同，且化学成分的含量差异也较大。

此外，本文使用MTT 法测定了丁岙杨梅果实挥发油对肿瘤细胞MGC-803、MCF-7 和A549 体外增殖的抑制作用。如图2 测定结果表明，丁岙杨梅果实挥发油表现了较好的抗肿瘤活性，在质量浓度为200 μg/mL 时对肿瘤细胞MGC-803、MCF-7 和A549体外增殖的抑制率分别为57.3%、42.0% 和42.4%。如图1 所示，其抑制作用并呈现浓度依赖性，随着浓度的变大，对三种细胞的体外增殖的抑制活性呈现增加的趋势。

丁岙杨梅果实挥发油化学成分较为复杂，含有大量的有机酸、酯、萜、酚、甾体、烷烃等，含有少量的醛类化合物，从而构成其特有的药用价值，对这些化学成分的提取分离和纯化以及利用还有待于深入研究，以实现对丁岙杨梅的深层次开发利用。

1 Xiao ZB(肖卓炳)，Chen S(陈上)，Ma MY(麻明友)，et al.Characterization of polyphenol oxidase in Myricarubra fruits.Food Sci(食品科学)，2009，30:306-308.

2 Ma HF(马惠芬)，Yan ZL(闫争亮)，Ze SZ(泽桑梓)，et al.GC/MS analysis of volatile components from leaf of Myricaesculenta Buch.-Ham.Guangdong Agric Sci(广东农业科学)，2011，38:88-89.

3 Yang XD(杨晓东)，Xiao SM(肖珊美)，Han Z(韩铮)，et al.GC-MS analysis of volatile components in bayberry(Myricarubra)fruit.J Fruit Sci(果树学报)，2008，25:244-249.

4 Li PP(李培培)，Qi XY(戚向阳)，Luo T(罗彤)，et al.Antioxidant activity of flavonoids extracts from different varieties of Chinese bayberry by chemiluminescence.J Chin Inst Food Sci Technol(中国食品学报)，2011，11:191-194.

5 Zhou JJ(周建俭).Study on the application of nisin in preserving Myricarubra fruits.Jiangsu Agric Sci(江苏农业科学)，2012，40:238-240.

6 Liu N(刘宁)，Li ZF(李正芬).Studies on germplasm resources of Myrica nana Cheval in Guizhou province.Seed(种子)，2004，23:80-82.

7 Qin H(秦红)，Song QQ(宋庆庆)，Hua XY(华晓燕).Bacteriostatic effect of waxberry wine on intestinal bacteria.Guizhou Agric Sci(贵州农业科学)，2012，40:157-159.

8 Sun SL(孙石磊)，Yao WR(姚卫蓉).Antibacterial activity of different extracts from Chinese waxberry fruit.Chin J Microecol(中国微生态学杂志)，2009，21:229-231.

9 Wu WB(吴文彬)，Wang BJ(王白娟).Study on extraction and activity of polyphenol in Myricaruba(Lour.)Zucc.In Yunan.Chinese Hortic Abstr(中国园艺文摘)，2010，11:5-8.

10 Wang XQ(王贤亲)，Pan XJ(潘晓军)，Lin D(林丹)，et al.Analysis of the essential oil from the leaves of ding-ao MyricaRubraby GC-MS.Food Res Dev(食品研究与开发)，2009，30:98-99.

11 Zhao MC(赵满仓)，Wei WQ(魏文青)，Liu J(刘晶)，et al.Study on the influencing factors of the MTT based tumor chemosensitivity assay in vitro.Chinese Clin Oncol(临床肿瘤学杂志)，2009，14:306-308.

12 Huang F(黄菲)，Luo M(罗曼).Evaluation of methyl thiazolyltetrazolium(MTT)assay for screening antitumor essential oils.Food Sci(食品科学)，2009，30:75-79.

13 Li MY(李明勇)，Huang PC(黄培春)，Kong X(孔霞).Detecting the anticancer effects of Squillaoratoria extract in vitro by MTT method.J Mod Oncol(现代肿瘤医学)，2005，13:336-337.