4种不同石竹属植物的抗旱性分析

王军娥，景维坤，王佳敏，亢秀萍

(山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801)

植物生长过程与外界环境密切相关，其中包括温度、光照、水分、土壤和养分等。目前全球面临着水资源严重缺乏的局面，我国很多地区属于干旱或者半干旱。因此，水资源短缺的现状，严重制约我国农业的快速发展[1]。石竹科(Caryophyllaceae)石竹属(DianthusL.)植物大多数为多年生草本植物，花色艳丽、花期较长且适应性强，在园林绿化中应用广泛。山西省内由于自然降雨量少，干旱环境制约石竹属植物的观赏价值和园林应用效果[2-3]。目前，关于石竹属植物的干旱胁迫研究多集中在水分胁迫对植株单个机理如形态、生理或光合特性等的影响方面[4-5]。研究表明，对任何单项指标和机理的研究都有一定局限性，不能有效、准确地评价植物抗旱性[6]。采用隶属函数法对多个指标进行综合评价，可以消除个别指标带来的片面性，从而提高筛选的可靠性[7]。

本试验通过分析干旱胁迫下4种不同石竹属植物的形态变化、生理机制和相关基因表达量的变化，探讨干旱对石竹属植物生长发育的影响，进而筛选出抗旱能力较强的石竹材料，为石竹属植物的抗旱种质资源筛选以及在山西省园林绿化中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验在山西省晋中市太谷县山西农业大学园艺学院园艺植物遗传育种实验室和花卉实践教学基地内完成。该地区处于东经112°28′～113°08′，北纬37°12′～37°32′，年平均气温5℃～10℃，年平均降雨量462.9 mm。

1.2 试验材料

试验材料为石竹科石竹属的瞿麦(DianthussuperbusL.)、常夏石竹(Dianthusplumarius)、中国石竹(DianthuschinensisL.)和须苞石竹(DianthusbarbatusL.)，编号分别为D1、D2、D3和D4，由山西农业大学园艺学院花卉种质资源创新团队收集并保存。在试验中，均选用纯度高、充实饱满、发芽率高的种子播种，选取长至8片真叶的幼苗进行后续干旱胁迫处理。

1.3 试验设计

本试验栽培基质为(园土∶树皮∶沙子=3∶1∶1)，其中园土为山西太谷本地土壤(褐土)。播种前每盆基质加5 g复合肥(N∶P∶K=1∶1∶1)，盆+基质2.2 kg，浇透底水后，盆+基质+水为3.96 kg，每盆土壤含水量一致。待石竹幼苗长至8片真叶时，选生长健壮、长势一致的幼苗进行干旱胁迫处理。每种390株(每盆种10株，13盆，花盆规格为36 cm×20 cm×16 cm)，重复3次。置于温室内，缓好苗后进行干旱胁迫。

每种取3盆作对照，另外10盆经干旱胁迫处理。对照组正常浇水，干旱处理组自然干旱，直至干旱死亡。在干旱胁迫处理0、2、4、6、8、10 d和12 d分别采顶部第3～4个叶片，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存。每个指标重复3次，并记录其生长状况，具体标准见表1。

表1 石竹属植物生长状况分级标准

1.4 测定项目及方法

1.4.1 生理指标 叶片相对含水量的测定采用烘干称重法[8]。叶绿素含量测定采用丙酮浸提法[10]。可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250比色法[9]。丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[10]。超氧化物酶歧化酶活性测定采用氮蓝四唑光还原法[10]。脯氨酸含量测定采用茚三酮显色法[10]。

1.4.2 实时荧光定量PCR 本试验使用RNAprep Pure Plant Kit(DP441，TIANGEN)试剂盒提取石竹叶片RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)将提取的RNA反转录成cDNA。以18srRNA为内参基因，SYBR®Premix Ex TaqTM II(Takara)实时定量试剂盒，比较抗逆性相关基因DtPOD和DtSOD在4种不同石竹属植物中的表达情况。

1.5 数据统计与分析

采用隶属函数法[11]对不同石竹品种的抗旱能力进行综合评价。隶属函数值的计算公式如下：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

或

U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)
i= 1，2，3，…

(2)

式中，Xi为某一指标的测定值/对照值，Xmin为所有供试材料该指标测定值/对照值中的最小值，Xmax为所有供试材料该指标测定值/对照值中的最大值。若所用指标与抗旱性呈正相关，用式(1)，反之用式(2)。计算出不同石竹品种的抗旱隶属值平均值，平均值越大，抗旱性越强。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下4种不同石竹属植物的形态变化

由表2可知，在干旱胁迫前期，4种植物的生长变化不明显；当干旱胁迫处理4～8 d时，中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)率先开始萎蔫，而常夏石竹(D2)和瞿麦(D1)仍保持正常生长；当干旱胁迫处理8～12 d，随着干旱胁迫程度加重，常夏石竹(D2)和瞿麦(D1)开始出现萎蔫，而中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)则受伤程度加重，停止生长甚至达到半致死程度。从外部形态变化可知4种石竹属植物的抗旱性大小为：常夏石竹(D2)>瞿麦(D1)>须苞石竹(D4)>中国石竹(D3)。

2.2 干旱胁迫下4种不同石竹属植物相关生理特性分析

2.2.1 干旱胁迫下石竹属4种植物土壤含水量变化 由图1可知，在整个干旱胁迫期间土壤含水量呈明显下降趋势，4种石竹属植物的土壤含水量下降趋势基本保持一致；4种植物土壤含水量在同一时期差异较小，但常夏石竹(D2)的土壤含水量在整个干旱胁迫过程中的整体水平较其它材料高。

表2 干旱胁迫下4种不同石竹属植物的生长状况

图1 干旱胁迫下土壤含水量变化Fig.1 The variation of soil moisture content under drought stress

2.2.2 干旱胁迫对石竹属4种植物叶片相对含水量的影响 由图2(A)可知，随着干旱胁迫天数的增加，4种石竹属植物叶片相对含水量整体呈下降趋势。干旱胁迫处理0～4 d时，各材料叶片相对含水量下降趋势基本一致。在干旱胁迫4 d时，瞿麦(D1)、常夏石竹(D2)、中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)的叶片相对含水量分别比对照组下降了17.94%、16.66%、22.88%和22.09%；在干旱胁迫10 d时，常夏石竹(D2)的叶片相对含水量最高，为43.63%，中国石竹(D3)最低，为22.72%。

2.2.3 干旱胁迫对石竹属4种植物叶片叶绿素含量的影响 由图2(B)可以看出，4种石竹属植物在干旱胁迫过程中，叶片叶绿素含量整体上呈先升后降的趋势。在干旱胁迫第4 d时，4种植物Chl含量均达到最高，随后呈下降趋势。在干旱胁迫第12 d时，4种石竹属材料叶片中的Chl含量从高到低依次为：常夏石竹(D2)>瞿麦(D1)>须苞石竹(D4)>中国石竹(D3)。

2.2.4 干旱胁迫对石竹属4种植物叶片丙二醛含量的影响 干旱胁迫下，丙二醛含量越多，则表明植物组织对逆境的防御能力越弱。由图2(C)可知，在干旱胁迫下，4种植物的丙二醛含量变化呈持续上升趋势。在干旱胁迫第10 d，4种不同材料丙二醛含量分别比对照组增加了451.61%、353.45%、724.32%、647.95%；在干旱胁迫12 d时，4种不同石竹属植物的丙二醛含量由大到小为：中国石竹(D3)>须苞石竹(D4)>瞿麦(D1)>常夏石竹(D2)。

2.2.5 干旱胁迫对石竹属4种植物叶片可溶性蛋白含量的影响 由图2(D)可知，在干旱胁迫第4 d时，中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)的可溶性蛋白含量分别增加31.23%和29.92%。在干旱胁迫第12 d，瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)的可溶性蛋白含量呈上升趋势，分别为对照的53.97%和63.12%，中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)可溶性蛋白含量则急剧下降，仅为对照的7.11%和8.88%。

2.2.6 干旱胁迫对石竹属4种植物叶片SOD活性的影响 由图2(E)可知，4种石竹属植物叶片SOD活性在干旱胁迫前期均呈现升高趋势。在干旱胁迫4～8 d期间，瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)SOD活性缓慢上升，而中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)SOD活性上升幅度较大；在干旱胁迫8～12 d，瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)SOD活性继续保持缓慢上升，而中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)SOD活性则大幅度下降。在干旱胁迫后期，4种石竹属植物仍保持较高的SOD酶活性，均高于初始水平，表明SOD酶活性与植物的抗旱性密切相关。

2.2.7 干旱胁迫对石竹属4种植物叶片脯氨酸含量的影响 由图2(F)可知，在干旱胁迫期间，4种石竹属植物叶片脯氨酸含量呈上升趋势。在干旱胁迫0～10 d，与对照组相比，4种石竹属植物叶片的脯氨酸含量均呈持续上升趋势，但是增加幅度不同。在干旱胁迫10 d时，须苞石竹(D4)脯氨酸含量增加最多，为对照组的12.73倍，其次是中国石竹(D3)，为11.21倍，瞿麦(D1)为8.02倍，常夏石竹(D2)增加最少，仅为4.75倍；干旱胁迫10～12 d，常夏石竹(D2)和瞿麦(D1)的脯氨酸含量继续增加而中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)则开始下降。

2.3 4种不同石竹属植物的抗旱性综合分析

本试验以石竹属4种不同植物的叶片相对含水量、SOD活性、Chl含量、MDA含量、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量6个生理指标，并结合隶属函数法进行耐旱性综合评价。从表3可知，4种植物的抗旱性从强到弱依次为：常夏石竹(D2)>瞿麦(D1)>须苞石竹(D4)>中国石竹(D3)。

图2 干旱胁迫对叶片生理指标的影响Fig.2 The effect of drought stress on the physiological indexes

材料编号Materialnumber叶片相对含水量Leaf relativewater contentChl.含量Chl. contentMDA含量MDA content可溶性蛋白含量Soluble proteincontentSOD活性SOD activityPro含量Proteincontent隶属函数总值 Total subordinatefunction隶属函数均值Mean subordinatefunction排名RankD10.74440.76670.78810.7590.7220.61154.39170.62742D20.93140.8810.90120.95270.83460.70735.20820.7441D30.04510.15240.13330.07880.24230.12780.77970.11144D40.14140.35720.23530.25450.12410.40361.51610.21663

2.4 4种不同石竹属植物的抗氧化酶基因表达分析

2.4.1DtPOD基因在4种不同石竹属植物中的表达分析 在干旱胁迫2、4、6、8、10 d，分别采集4种不同石竹属植物叶片提取RNA，检测DtPOD基因的表达情况。从图3(A)可知：在整个干旱胁迫期间，DtPOD基因在4种不同石竹属植物叶片中的表达水平呈先升后降的趋势；干旱胁迫第6 d时，常夏石竹(D2)和瞿麦(D1)的DtPOD基因表达量达到了最大值，常夏石竹(D2)的变化倍数为对照组的24.18倍，瞿麦(D1)为对照组的15.01倍；干旱胁迫10 d时，与对照组相比，常夏石竹(D2)DtPOD基因相对表达量仍高达12.82倍，其次是瞿麦(D1)为3.75倍，须苞石竹(D4)为0.34倍，中国石竹(D3)最低，仅为初始表达量的0.15倍。

2.4.2DtSOD基因在石竹属4种植物中的表达分析 干旱胁迫下，DtSOD基因在4种不同石竹属植物中的表达情况如图3(B)所示。从图中可知，在干旱胁迫前期(0～4 d)，DtSOD基因在瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)的表达量呈略微下降趋势，而须苞石竹(D4)和中国石竹(D3)的表达量显著增加且在处理4 d时表达量达到最高值；干旱胁迫第10 d时，与对照相比，DtSOD基因在4种不同石竹属植物的表达量差异较大，从高到低依次为：常夏石竹(2.46倍)>瞿麦(2.17倍)>须苞石竹(0.40倍)>中国石竹(0.23倍)。

图3 干旱胁迫下4种不同石竹属植物的基因表达分析Fig.3 Analysis of gene expression in four Dianthusplants under drought stress

3 讨 论

3.1 抗旱性生理指标分析

植物的光合速率大小与植物体内的水分状况直接相关，而植物体内的水分大部分是由根系从土壤中获取，光合速率大小间接地与土壤水分状况密切相关[12]。在土壤缺水的情况下，植物光合速率受到抑制[5]。在相同的干旱胁迫条件下，抗旱性强的植物叶片含水量下降慢且降幅小，能保持较好的水分平衡；反之，相对含水量下降的快且幅度大，水分平衡能力差，植物的抗旱能力弱[13]。本试验中瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)的叶片相对含水量下降幅度较须苞石竹(D4)和中国石竹(D3)小，说明瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)的抗旱性相对较强。

叶绿素是参与植物光合作用的重要物质，叶绿素含量变化可以反映植物受干旱胁迫的程度[11]。本试验干旱胁迫前期，4个供试材料Chl含量均呈上升趋势。干旱胁迫下，Chl含量变化的这种差异可能与植物自身的生物学特性和干旱胁迫发生的强度、时期或持续时间有关[14]。

干旱胁迫对植物的伤害首先表现为膜脂过氧化[15]，MDA含量的高低反映了膜脂过氧化以及膜结构受伤害的程度[16]。本试验中，随干旱胁迫时间的延长，MDA含量增加。在干旱胁迫的前6 d，MDA含量上升相对缓慢，但在干旱胁迫10 d后，发现中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)MDA含量降低，可能是由于干旱胁迫程度严重，植物产生的活性氧含量降低，导致MDA含量降低，说明中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)的抗旱性弱于瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)。植物在抵御不良环境时，其自身会形成一些防御机制，如启动抗氧化系统、进行渗透调节等[17]。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等抗氧化酶是植物活性氧清除系统中重要的酶，在一定胁迫范围内可以维持活性，在干旱胁迫2 d后其活性大幅度提高，6 d后开始下降；而Pro含量在干旱前期增加缓慢，4 d后开始迅速积累，表明在干旱前期，抵御干旱的渗透性物质主要为可溶性蛋白质，而在干旱后期，即干旱胁迫程度较大时，主要发挥作用的渗透性物质是脯氨酸[18-21]。干旱胁迫使SOD活性升高，但每个材料SOD活性增加趋势有差异。根据马宗仁等[22]的时间差理论，植物存在一个耐受胁迫的极限。中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)在干旱胁迫8d后，SOD活性达到了耐旱胁迫，随后SOD活性开始急剧下降；瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)则在干旱胁迫前期SOD活性下降，随后SOD活性平稳上升，表现出对干旱胁迫有较强的适应性。

3.2 抗氧化酶基因表达量分析

本试验中，两个基因在4种石竹属植物不同干旱胁迫时期的相对表达量变化趋势不一致。在干旱胁迫前期，DtPOD基因的表达量在瞿麦(D1)和常夏石竹(D2)较中国石竹(D3)和须苞石竹(D4)增幅大，其抗旱性强弱与表达量呈正相关，表达量越高，其抗旱性越强。对于DtSOD基因，干旱胁迫前期，抗旱性强的植物SOD酶活较低；在干旱胁迫中后期，酶活性逐渐升高，抗旱性越强，该基因表达量越高，可能是由于基因调控表达在时间和空间上的差异导致，因此需要深入探究。

综上所述，在不同的干旱胁迫处理下，4个不同石竹属植物在形态、生理以及抗氧化酶基因表达方面表现出不同的反应。结合隶属函数法对干旱胁迫下的不同指标进行综合评价，得出4个不同石竹属植物的耐旱性由强到弱依次为：常夏石竹(D2)>瞿麦(D1)>须苞石竹(D4)>中国石竹(D3)。