CAR在具有细支气管肺泡癌特征肺癌中的表达及意义

郭 燕 张 军 李海欣 战忠利

随着以腺病毒（adenovirus，Ad）载体为基础的基因治疗研究的逐渐深入，如今介导病毒亲嗜性的受体已备受关注。柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）是柯萨奇B组病毒和Ad共用于细胞膜上的同一受体。近年研究发现，细胞表面CAR表达水平不仅同Ad转染效率直接相关［1-2］，更重要的是CAR在肿瘤细胞中亦有表达，并有研究显示其同肿瘤的发生发展具有相关性［3-4］。然而国内外对于肿瘤相关性的研究多停留于体外细胞系的实验研究［5］，在人体肿瘤研究方面却鲜见报道。本研究选取在前期研究［6］中CAR阳性表达率最高的肺腺癌部分亚型为主要研究对象；并依据2004年版WHO肺癌病理学分类标准及2006年中国抗癌协会肺癌专业委员会召开的“第三届中国肺癌高峰共识会”提出的分类标准［7］将单纯型BAC（pure bronchioloalveolar carcinoma）、支气管肺泡细胞癌伴局部浸润（BAC with focal invasion，BWFI）和具有支气管肺泡细胞癌特征的腺癌（adenocarcinoma with BAC feature，AWBF）三种类型统一归类于具有支气管肺泡癌特征的肺癌（pulmonary adenocarcinoma with features of bronchioloalveolar carcinoma，PWBF）。本研究旨在探讨CAR蛋白表达及其同临床病理因素的关系，并初步分析CAR蛋白的阳性表达率与患者生存期的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2006年1月至2009年12月间天津医科大学肿瘤医院手术切除并经病理确诊及有详尽随访资料的PWBF患者的存档蜡块137例，男性56例，女性81例；年龄36～78岁，中位年龄为61岁；pTNM分期Ⅰ～Ⅳ期，伴有淋巴结转移者59例，无淋巴结转移者78例；另收集同期其它类型肺癌（非PWBF）24例及肺组织良性病变标本30例。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人CAR多克隆抗体（CARH300）为浓缩液，工作浓度为1∶100，为美国Santa Cruz公司产品；二步法免疫组织化学检测试剂盒（即EnVisionTM即用型试剂）购于基因科技（上海）有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色 所有标本均经10%甲醛溶液固定及常规的石蜡包埋。从每例3～4块肿瘤标本蜡块中选择具有代表性蜡块，将标本制成4 μm厚连续切片。将切片常规脱蜡至水后，浸入煮沸的0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）进行高压修复。室温自然冷却后蒸馏水冲洗，以0.3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶处理15 min，蒸馏水冲洗后，将切片置入PBS缓冲液中，浸泡5 min，3次。滴加一抗（浓度为1∶100），4℃过夜。之后依据EnVision试剂盒说明书进行操作，行DAB染色，苏木素衬染，中性树胶封片。选取阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定标准 采用随机法选取视野，阳性定位于细胞膜和（或）细胞浆，呈浅至深棕黄色颗粒沉着，判定标准：1）100倍光镜下观察，根据细胞染色强度计分：未染色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。2）400倍光镜下随机观察5个视野，每个视野计数100个细胞，计算细胞染色百分率：无阳性细胞为0分，阳性细胞＜25%为1分，阳性细胞25%～50%为2分，阳性细胞＞50%为3分。将1）和2）中所得数值相加，计算积分。0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中度阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。表达程度分为：（-）～（+）为阴性表达，（++）～（+++）为阳性表达。

1.2.4 随访 患者的随访采用病例跟踪、电话及信件随访的方式，随访时间从手术日开始到死亡或者最后一次随访；以月为单位计算，随访时间满3年截止。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各组间的阳性率比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAR蛋白的表达

CAR蛋白阳性产物定位于细胞膜和（或）细胞浆，呈棕黄色颗粒。其在正常肺组织染色较浅及多呈灶性分布，而在肺癌组织中染色较重（++）～（+++），多呈弥漫性分布（图1）。由表1可见，CAR蛋白在正常肺组织中的表达率为13.3%，在癌组织中的表达率为68.3%，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）。而在PWBF及非PWBF两组间亦有统计学差异（P＜0.05）。

2.2不同组织学分类与CAR的表达

在PWBF中，单纯型BAC组的阳性表达率最高，且3组间有统计学差异（P＜0.05，表2）。

2.3 临床病理特征与CAR的表达

CAR蛋白的表达与性别、年龄、吸烟指数、肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期各因素间无统计学差异；随着肿瘤分化程度的降低，其阳性例数减少，阳性率降低（P＜0.05，表3）。

2.4 CAR蛋白表达与患者生存期的相关性

137例肺癌中，98例阳性表达患者的平均生存时间为33.03个月，39例阴性表达患者的平均生存时间为31.90个月，两组总生存率差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

图1 CAR在AWBF中的表达 （EnVision×400）Figure 1 Positive expression of CAR in PWBF （EnVision×400）

表1 CAR蛋白在肺癌和正常肺组织中的表达Table 1 CAR protein expression in lung cancer and normal tissues

表2 CAR蛋白表达与病理分型的相关性Table 2 Relationship between CAR protein expression and adeno-carcinoma subtypes

表3 CAR蛋白表达与临床病理因素的关系Table 3 Relationship between CAR protein expression and clinical factors

3 讨论

CAR于1997年通过免疫亲和层析的方法得到分离和识别。该受体属于细胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族。目前已证实CAR表达于多种肿瘤组织中，如食管癌、结肠癌、胃癌、胶质瘤等［1，3，8-9］。本研究亦在前期研究中，运用RT-PCR、Western Blot等方法皆证实了其在肺癌组织中的表达，并发现其在BAC中高度表达。然而不足之处在于未进行CAR蛋白表达同患者临床预后的相关性研究，另外入组病例中BAC的例数较少且并未严格区分单纯的BAC和含BAC成分的混合型腺癌。故而此次研究在扩大BAC病例数的同时将单纯型BAC、BAC伴局部浸润及具有BAC特征的腺癌全部纳入了研究范围。

本研究证实了CAR蛋白在癌组织中的阳性率显著高于正常组织，表明CAR的异常表达与肺癌的发生发展相关，并进一步明确了CAR高度表达于PWBF中，且在单纯型BAC中表达最高，表明其与PWBF的关系密切并提示其与肺腺癌某些亚型（PWBF）的形成及发展密切相关。本研究在收集PWBF患者的病例时，发现这些患者常伴有慢性肺疾病，而炎症反应［8］能够诱导CAR表达，这可能是CAR在PWBF中得以高度表达的因素之一。同时研究发现CAR的表达与组织学分级相关，随着肿瘤细胞分化程度的降低，CAR阳性率降低。在对71例胃肠道恶性肿瘤进行CAR表达情况的研究中发现：在中低度分化程度的恶性肿瘤组织中，CAR蛋白表达降低甚至缺失；他们认为CAR的缺失性表达可作为恶性肿瘤“失分化性”的标记物并应用于临床［8］。Lacher等［10］认为造成CAR表达的差异，甚至出现缺失性表达是由于上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）所致。伴随肿瘤细胞分化程度的降低，肿瘤恶性程度的增加，作为重要的上皮表型之一的CAR蛋白逐渐减少、消失，而这些上皮细胞的多形性改变和去分化表现恰是肿瘤演进的标志。

近十年来，腺病毒载体是目前肿瘤基因治疗研究中应用最多的一种病毒载体，而CAR介导的Ad进入靶细胞是基因转移中的限速步骤［11-13］，并有研究显示CAR的表达增加可明显提高腺病毒对于各细胞的感染效率。另外Miyamoto等［14］发现CBV3是一个免疫刺激性的溶瘤病毒，对于肺腺癌是一种很有前途的抗癌疗法，然而CBV3的感染率［15］及抗肿瘤活性是与其相关受体（CAR）的表达呈正相关的。故而在PWBF中的高表达为肺癌部分亚型的治疗提供了新的治疗策略。然而对于临床治疗的应用价值远非如此，在化疗药物顺铂和组蛋白脱乙酰酶抑制剂FR901228及TGF-β抑制剂［11］作用下肿瘤细胞 CAR的表达水平也会提高，腺病毒感染效率也显著提高。这些研究说明CAR蛋白的表达是可以高度调控的，这将为CAR表达较低的肺癌亚型提供良好的应用前景。

综上所述，尽管CAR真正的生物学功能尚不清楚，但它在肺癌部分亚型的高度表达及其可调节性为所有肺癌患者进行基因治疗带来了希望，同时其在肺癌诊治中的应用也将必然有着广阔的前景；此方法可能在继EGFR-TKI靶向生物治疗后，成为极富前景的治疗途径。

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