EZH2和Ki-67蛋白在腺样囊性癌中的表达及其临床意义

褚金曼 杜咏梅 骆树瑜 李 蕊 董 瑞

涎腺腺样囊性癌（salivary adnoid cystic carcinoma，SACC）是常见的恶性涎腺肿瘤之一。SACC的发生不仅涉及到癌基因、抑癌基因、DNA损伤修复基因等多种基因本身的突变，还涉及到DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学的改变，与异常的表观遗传调控相关［1］。EZH2（enhancer of zeste homolog2）是表观遗传调控因子PcG（polycomb group）蛋白核心成分［2］，是具有组蛋白甲基转移酶活性的癌相关蛋白，与肿瘤的发展进程密切相关，因而近年受到广泛关注。本课题通过研究EZH2蛋白和增殖指标Ki-67蛋白在腺样囊性癌组织中的表达，探讨EZH2与SACC临床病理特征之间的关系以及EZH2与SACC增殖水平之间的关系，从而进一步了解EZH2在SACC进展过程中的调节机制，为肿瘤的创新性治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取天津医科大学口腔医院1983年2月至2013年2月正常腺体组织5例，腺样囊性癌存档蜡块42例，男性17例，女性25例，年龄22～75岁，平均年龄47.29岁。根据WHO（2005）关于SACC的病理分类标准，筛状型18例，管状型10例，实体型14例。其中年龄＜50岁31例，＞50岁11例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期32例。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 所有标本均经10%中性福尔马林缓冲溶液固定后，常规脱水、透明、石蜡包埋，5 μm连续石蜡切片，切片贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，80℃烘片，行免疫组织化学染色。

1.2.2 主要试剂 即用型兔抗人EZH2多克隆抗体、即用型兔抗人Ki-67多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），SP通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

1.2.3 免疫组织化学 采用SP免疫组织化学染色法检测EZH2蛋白和Ki-67蛋白的表达，按照试剂盒说明书严格操作，用PBS代替一抗做阴性对照。脱蜡至水，已知阳性乳腺癌组织作为EZH2、Ki-67的阳性对照组。微波抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗4℃过夜，二抗孵育，DAB显色、复染、脱水、透明、封片。

1.2.4 结果判定 EZH2和Ki-67均主要表达在细胞核，用双盲法观察染色结果，半定量积分法分析结果，每例随机观察5个高倍视野（×400），每高倍视野计数100个瘤细胞。染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再按阳性细胞所占的百分比评分：阴性为0分，阳性细胞＜25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。总体评分值=阳性细胞比例评分×染色强度评分，总分≤3分为阴性（-），3～6分为阳性（+），＞6分为强阳性（++）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0进行统计学处理，样本阳性率采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EZH2蛋白的表达与临床病理特征的关系

在腺样囊性癌组织中EZH2蛋白的表达主要位于细胞胞核，呈黄色或棕黄色的颗粒沉淀（图1）。统计结果显示，EZH2蛋白在腺样囊性癌组织中的阳性率为66.67%（28/42），5例正常涎腺组织中仅有1例的细胞胞核表达EZH2，其阳性范围≤10%，根据结果判断标准为阴性。两者比较差异有统计学意义（χ2=5.71，P＜0.05）。在腺样囊性癌组织中，EZH2在SACC实体型的表达水平高于筛状/管状型（P＜0.05），TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者EZH2蛋白的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05）。不同患者性别、年龄、发病部位间差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.2 Ki-67蛋白表达与临床病理特征的关系

在腺样囊性癌组织中Ki-67蛋白的表达也主要位于癌细胞胞核，呈黄色或棕黄色颗粒（图2）。统计结果显示，Ki-67蛋白在腺样囊性癌组织中的阳性率为78.57%（33/42），5例正常涎腺组织中未见表达，两者差异有统计学意义（χ2=9.70，P＜0.05）。在腺样囊性癌组织中，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者Ki-67蛋白的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。Ki-67在SACC实体型的表达水平高于筛状/管状型（P＜0.05）。不同患者性别、年龄、发病部位间差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 EZH2和Ki-67蛋白表达水平的关系

在Ki-67阳性的33例腺样囊性癌患者中，25例E2H2表达阳性，表达率75.76%（25/33），Ki-67阳性表达的9例中，3例EZH2表达阳性，表达率33.33%（3/9），两者比较有统计学意义（P＜0.05）。EZH2和Ki-67蛋白在SACC中的表达趋势一致：在实体型中EZH2和Ki-67两种蛋白的表达水平均升高，在筛状/管状型中EZH2和Ki-67阳性细胞的范围均较小。

图1 EZH2在腺样囊性癌中呈阳性表达 （SP×400）Figure 1 Positive expression of EZH2 in SACC （SP×400）

表1 腺样囊性癌组织中EZH2表达与临床病理特征的关系Table 1 Correlation between EZH2 expression and clinicopathological characteristics of salivary adenoid cystic carcinoma tissue

图2 Ki-67在腺样囊性癌中呈阳性表达 （SP×400）Figure 2 Positive expression of Ki-67 in SACC （SP×400）

表2 腺样囊性癌组织中Ki-67表达与临床病理特征的关系Table 2 Correlation between Ki-67 expression and clinicopathological characteristics of salivary adenoid cystic carcinoma tissue

3 讨论

SACC是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，多见于中老年人，以腮腺和硬腭部多见。生长缓慢，但生存率低。Kokemueller等［3］报道74例腺样囊性癌患者经手术切除及局部放射治疗后，其总体5年生存率为71%，而10年生存率和15年生存率则分别为54%和37%。SACC的发生、发展是各种原因使原癌基因激活、抑癌基因失活，从而使细胞增殖和凋亡失调所致。近年发现，表观遗传变异在肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要作用，其作用形式主要包括调节细胞周期和阻断下游基因。表观遗传（Epigenetics）是指通过多种形式对稳定的DNA序列或蛋白进行修饰，从而使基因表达发生了可遗传的改变。这种改变能够稳定保留，但也能够在细胞增殖过程中和环境因素影响下迅速转变。因此得出肿瘤细胞基因组的表观遗传修饰与稳定的基因组DNA序列相比更具有灵活性，对疾病的影响作用不容置疑［4］。

EZH2是多聚梳群（polycomb group，PcG）基因家族重要成员之一，同时也是重要的表观遗传修饰酶，通过甲基化核小体组蛋白H3的27位赖氨酸残基，使下游基因沉默。这些下游靶基因大部分具有抑制肿瘤发生的作用，它们的沉默将解除对肿瘤发生的抑制，导致肿瘤形成。除此之外，EZH2还介导参与细胞周期调控、细胞衰老和细胞分化［5］。有研究［6］报道，在卵巢癌组织中，EZH2的高表达与其组织学分级及疾病晚期存在明显相关性，并进一步指出EZH2可以通过调控转化生长因子β（TGF-β1）的表达影响细胞的迁徙和侵袭能力。Lu等［7］研究发现，EZH2不仅在卵巢癌组织及癌细胞中高表达，相对正常内皮细胞，其在肿瘤相关内皮细胞中亦呈现高表达。并进一步发现，在肿瘤相关内皮细胞中血管内皮生长因子（VEGF）直接调控EZH2的表达，EZH2再通过抑制强抗血管生成因子（vasohibin1，VASH1）的活化参与肿瘤血管的发生。人类乳头瘤病毒（HPV）阳性的宫颈癌细胞通过HPV16 E7活化转录水平的EZH2基因表达而参与其细胞周期的调控，并且通过诱发G1～S期细胞进入分裂期来促进癌细胞增殖［8］。有学者发现EZH2在胃癌中的表达水平高于正常组织，认为EZH2基因可以促进胃癌的发生发展［9］。Ki-67是一种细胞增殖核抗原，位于第10号染色体，其蛋白的表达具有细胞周期特异性：G1中晚期开始表达，S期、G2期逐渐增加，在M期达到高峰，M后期逐渐降解或丢失抗原决定簇，在G0期细胞没有表达。因此能有效的反应细胞增殖状态，目前已被广泛应用于研究、评估肿瘤的增殖活性及生物学行为。研究表明与正常卵巢表面上皮相比，在原发性卵巢上皮性癌中EZH2明显高表达，并且其表达与增殖指标Ki-67显著相关［10］。Bondgaard等［11］通过研究EZH2与Ki-67在96例肺神经内分泌肿瘤中的表达发现二者具有显著相关性（P＜0.001），并且表达水平存在一致性，表明EZH2预示着高度增殖。曹相玫等［12］通过检测EZH2与Ki-67蛋白在不同分化级别的原发性肝癌组织中的表达水平发现两者的表达趋势一致，并且在低分化原发性肝癌中EZH2的表达水平明显高于Ki-67，提示EZH2能更为敏感的反应细胞增殖，为临床诊断提供了更为敏感的指标。但EZH2蛋白表达与腺样囊性癌的临床病理特征和增殖状态是否相关，目前鲜见报道。

本研究结果显示，SACC的实体型和筛状/管状型组织的EZH2蛋白阳性表达率分别是92.86%（13/14）、53.57%（15/28），两者之间的差异有统计学意义（χ2=4.83，P＜0.05），EZH2蛋白在实体型中的表达明显高于筛状/管状型中的表达，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者的EZH2蛋白的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），因此认为EZH2的表达水平与SACC的组织学类型及临床分期相关。Vékony等［13］研究分析得出与筛状和管型相比，EZH2表达水平更高的实体型ACC患者生存率更低。本研究应用Ki-67作为观察细胞增殖的辅助指标，分析EZH2与SACC细胞增殖能力的关系。结果显示，SACC的实体型和筛状/管状型组织的Ki-67蛋白阳性表达率分别是100.00%（14/14）、67.86%（19/28），两者之间的差异有统计学意义（χ2=3.97，P＜0.05），Ki-67蛋白在实体型中的表达明显高于筛状/管状型中的表达，即Ki-67的表达水平与SACC的组织学类型相关。该结果还提示Ki-67与EZH2蛋白在SACC中的表达趋势相一致。部分学者通过Ki-67的表达来评估EZH2与肿瘤细胞增殖之间的关系，发现二者具有显著相关性［14］。并且有研究［15］显示，在卵巢癌细胞株OVCAR-3中，siRNA介导的EZH2表达下调，可使OVCAR-3的增殖能力明显下降，提示EZH2基因可以调节卵巢癌细胞的增殖。以上结果表明EZH2蛋白在细胞周期管理中起作用，进一步推断EZH2的表达水平能够反映细胞的增殖状态。在相对较大样本含量中，EZH2在33例低分化肿瘤中的表达率明显高于67例高分化肿瘤（P＜0.000 1），并且EZH2与Ki-67之间具有显著相关性（P＜0.001）［11］。另外，为了更客观的体现在低分化和高分化肿瘤中EZH2和Ki-67表达之间的相关性，本研究将在后期的实验中增加样本数量进行综合评价。

综上所述，EZH2能够成为提示SACC临床分期、病理分型及增殖能力的分子标志物，对临床诊断具有一定的参考价值。

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