喉鳞状细胞癌RECK基因甲基化状态与放疗敏感性的关系

崔 静 李 辉 卢琳琳

喉癌在人类恶性肿瘤中所占比例不足2%，但其发病率具有较大的区域性差异，好发于60～70岁，以男性高发，其病因目前尚不完全明确［1］。有研究［2］报道，过量的吸烟、饮酒、HPV感染等均为诱发喉癌的危险因素。DNA异常甲基化是恶性肿瘤的早期事件，并可以作为某些肿瘤诊断和预后的生物标志。RECK（reversion-inducing cysteine rich protein with kazal motifs）是一种新型抑癌基因，具有抑制肿瘤细胞再生、浸润和转移的作用。有研究［3-4］表明，RECK基因表达下降与启动子区的甲基化有关。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶的激活引起，其在肿瘤发生、发展过程中的重要作用已引起人们越来越多的关注。此外，有研究［5］报道DNA错配修复失败与体外培养的癌细胞株对放化疗药物的敏感性有重要关系，但其临床相关性尚不明确。病理学上大多数喉癌是鳞状细胞癌。及早识别放疗后影响喉鳞状细胞癌药物敏感性的表观遗传变化，对制定个体化化疗方案具有重要的临床意义。本研究检测了原发性喉鳞状细胞癌组织和正常喉黏膜组织RECK基因启动子区甲基化状态，探讨RECK基因甲基化与放疗敏感性及治疗效果是否存在某种关联，旨在为预测放疗敏感、提示预后提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

选取2006年7月至2007年12月在本院接受治疗的喉鳞状细胞癌患者为研究对象，在外科手术切除术前填写知情同意书。所有标本均经手术切除并经病理学检查明确诊断，排除合并其他恶性肿瘤者及术前接受过抗肿瘤治疗（化、放疗等）者。最终70例患者纳入本研究，其中男性52例，女性18例，年龄32～64岁，平均年龄（45.23±8.36）岁（排除年龄≥65岁患者），其他病理参数见表1。喉鳞状细胞癌标本经石蜡包埋，-70℃储存。另随机选取同期15例健康者的喉黏膜标本为对照组。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 蛋白酶K（北京艾比根生物技术有限公司），Tris-Base（上海拜沃生物科技有限公司），Wizard DNA Clean-Up System（美国Promega公司），Tap酶（美国Invitrogen公司），甲基化转移酶（M.SssI）（美国NEB公司），引物、三氯甲烷、饱和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠、无水乙醇（大连宝生生物公司）。恒温水浴箱（美国SHELLAB公司），高速离心机（德国Eppendorf公司），Gene Amp 9700型PCR扩增仪（美国ABI公司），凝胶自动成像仪（TOCAN 320型），电泳仪（美国伯乐公司）。

1.2.2 DNA提取 采用标准蛋白酶K消化法进行DNA提取，在提取之前，组织标本经苏木精、伊红染色肿瘤细胞，并选择喉癌细胞≥75%区域的组织提取DNA。

1.2.3 亚硫酸氢钠修饰 参照试剂盒说明进行操作：先将约2 μg DNA在1.5 mL EP管中，用双蒸水稀释至50 μL，加5.5 μL新鲜配制的3M NaOH后42℃水浴30 min，然后加30 μL 10 mM对苯二酚至上述水浴后的混合液中；再加入520 μL 3.6M亚硫酸氢钠，加200 μL石蜡油，50℃避光水浴16 h。

1.2.4 修饰后DNA纯化回收 预热树脂10 min（37℃），将移液器枪头伸入石蜡油层下吸取混合液600 μL于洁净2 mL EP管中；然后使用Promega Wizard Clean up DNA纯化回收系统，对修饰后的DNA进行纯化回收。

1.2.5 甲基化特异性PCR反应 PCR反应体系：去离子水11.65 μL；10×Buffer 2 μL；dNTP 1.6 μL；上、下游引物各1 μL；DNA模板3 μL；Tap酶0.15 μL；加去离子水至20 μL。循环参数：94℃预变性5 min后35个循环：94℃变性30 s，54℃复性30 s，72℃延伸30 s，最后1个循环延伸5 min。将产物琼脂糖凝胶（2.5 g/L）电泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶处理、未处理的正常人外周血细胞、去离子水分别作为甲基化阳性对照、甲基化阴性对照及空白对照。每批标本同时扩增甲基化和非甲基化阳性对照。甲基化上游引物5'-GTTAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTCG A-3'，下游引物 5'-TCCAAAACCTCCCGAAAACGAA AACG-3'；非甲基化上游引物5'-GGTTAGTTTTTTT TTTTATTTTAGTGGTTTGA-3'，下游引物 5'-ATTTCC AAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3'。

1.3 临床资料

手术后所有患者均在本院放射科接受6个周期的放疗，2 Gy/次，1次/d，5 d为1个周期，总剂量66～72 Gy。放疗疗效评定标准：完全缓解（CR）：影像学未发现肿瘤或肿瘤消失，症状、体征消失，维持≥4周，胸苷激酶或鳞状细胞癌相关抗原均在正常值范围内（胸苷激酶≤2 pmol/L，鳞状细胞癌相关抗原≤1.5 ng/mL）；部分缓解（PR）：影像学暂未发现肿瘤或肿瘤消失，症状、体征部分消失，维持＜4周，胸苷激酶及鳞状细胞癌相关抗原较原来增高20%～50%；稳定（SD）：临床症状、体征、血清学指标未见明显改变；进展（PD）：影像学发现肿瘤，临床症状、体征加重，胸苷激酶和鳞状细胞癌相关抗原较原来增高1倍以上。

患者在接受6个放疗周期后结合上述标准，界定放疗敏感与放疗不敏感。CR、PR为放疗敏感组，SD、PD为放疗不敏感组。随访截至2013年1月，将完成5年随访的患者分为缓解组（CR、PR）和未缓解组（SD、PD）。

1.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件进行处理。RECK基因启动子区甲基化状况与临床病理参数关系采用Pearson χ2检验，必要时采用Fisher确切概率法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床及病理学特征

70例患者中共37例（52.86%）发生RECK基因甲基化。经χ2检验，RECK基因甲基化在不同年龄、性别、吸烟史、饮酒史等方面差异无统计学意义（P＞0.05）；但在有无淋巴结转移、TNM临床分期及不同肿瘤分化程度间差异无统计学意义，有淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期、低分化肿瘤患者RECK基因甲基化率分别高于无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期、中分化和高分化的患者（表1）。部分喉癌组织RECK基因甲基化特异性PCR电泳见图1。

表1 70例喉鳞状细胞癌患者病理参数RECK甲基化情况比较Table 1 Methylation status of RECK among different pathological parameters

2.2 RECK基因甲基化与放疗敏感性的关系

经6个周期放疗后，47例（67.14%）患者对放疗敏感，23例（32.86%）患者对放疗不敏感。经χ2检验，两组RECK基因甲基化率差异有统计学意义（χ2=6.095，P=0.014），放疗敏感组RECK基因甲基化水平低于放疗不敏感组（表2）。

2.3 RECK基因甲基化与治疗效果的关系

本组患者共64例完成5年随访，其中缓解组45例，未缓解组19例。经χ2检验，缓解组和未缓解组RECK基因甲基化率差异有统计学意义（χ2=11.532，P=0.001），缓解组RECK基因甲基化水平低于未缓解组（表3），RECK基因甲基化可使肿瘤未缓解的危险增高5.010倍（OR=5.010，95%CI：1.616～15.533）。

图1 部分喉癌组织RECK基因甲基化特异性PCR电泳图Figure 1 RECK methylation-specific PCR electrophoresis in part of laryngeal cancer tissues

表2 放疗敏感组和放疗不敏感组RECK基因甲基化率比较Table 2 RECK methylation rate between the groups with radiation-sensitivity and without

表3 缓解组和未缓解组RECK基因甲基化率比较Table 3 RECK methylation rate between remission and nonremission group

3 讨论

RECK基因具有抑制肿瘤转移的作用，其编码的蛋白通过GPI锚定在细胞膜上，通过抑制金属基质蛋白酶达到抑制肿瘤转移的作用。在直肠癌及口腔鳞癌的研究中，甲基化RECK基因编码的蛋白水平下降，抑制肿瘤转移的作用下降。有研究［6］表明，甲基化水平会与放疗疗效呈一定相关性。关于喉癌的RECK基因甲基化状态鲜见研究，本研究旨在揭示RECK基因甲基化状态是否与喉鳞状细胞癌的放疗敏感性及疗效有关。实验结果显示，CpG岛甲基化过表达在喉鳞状细胞癌中常见，正常喉黏膜组织均未见RECK基因甲基化，提示抑癌基因RECK甲基化可以作为恶性肿瘤早期发生的生物学标志。另外，70例患者中47例（67.14%）患者对放疗敏感，其中20例（42.55%）具有RECK甲基化；23例（32.86%）对放疗不敏感，其中17例（79.31%）具有RECK甲基化，两组的RECK基因甲基化率差异有统计学意义（P＜0.05），提示RECK基因启动子区甲基化与放疗敏感性存在某种关联，根据其甲基化状态可以预测治疗效果和预后。

近年来，抑癌基因的甲基化对恶性肿瘤的发生、发展、预后的作用受到人们的关注。有研究［6-7］表明抑癌基因的失活引起表达下降，而对放疗敏感的癌细胞株中，RECK基因表达高于放射不敏感组。本研究结果显示，放疗敏感组的RECK基因甲基化率低于放疗不敏感组（P＜0.05），其机制可能是放射线刺激喉癌细胞中RECK基因表达，进而抑制肿瘤细胞分化，达到放疗的效果，这可能是放疗敏感组预后较好的原因［8-10］；而RECK基因甲基化可以降低RECK基因的表达而无法发挥抑制肿瘤分化的作用，可能表现放疗不敏感。目前，对于RECK基因与放疗敏感性关系的研究较少，但是对于抑癌基因家族其他基因型的研究屡见报道。有研究［8］提示放射线可引起宫颈癌细胞p73基因高表达，在放射敏感细胞中p73基因的表达水平较放射不敏感的细胞高，与本研究结果一致。但这一结论目前尚存争议。有研究［8］认为，肿瘤组织中p73甲基化过表达通常提示预后较好；放疗敏感的食管癌组织p73甲基化水平高于放疗抗拒者。本研究认为造成上述研究结果不一致的原因可能与研究的肿瘤类型有关［11-13］。

从临床治疗的角度而言，放疗仍然是恶性肿瘤患者重要的治疗措施，对放疗的敏感与否直接关系到治疗效果的优劣［14］。但是，目前临床上仍缺乏一种快速、有效、准确的预测患者放疗敏感性方法，这是影响恶性肿瘤放疗效果的一大重要原因［15］，本研究为解决这一问题提供了新的思路。本组结果提示，RECK基因甲基化水平与喉鳞状细胞癌的放疗敏感性和预后有关，对早期预测喉鳞状细胞癌患者的放疗敏感性，尽早制定个体化治疗方案，对提高喉鳞状细胞癌的抑制率和判断其预后有重要意义。但抑癌基因甲基化水平是近年来开始研究的新型生物标志物［16］，其潜在价值仍需大量的大样本研究进一步证实，同时需在临床实践中加以验证。

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