骨髓增生异常综合征(MDS)基因诊断研究

冯宝章 郝建萍 雷健玲 邵宗鸿

众所周知，骨髓增生异常综合征(MDS)又称白血病前期，有5个亚型。其中难治性贫血(RA)是它们的基本型，可以转化为原始细胞增多的 RA(RAEB)和转化中的RAEB(RAEBT)，以及急性白血病(AL)。MDS诊断的难点在于RA以及同其他已知贫血出血病的鉴别诊断。笔者曾以V－erbB和V－erbB+A为探针Southern印迹杂交法对MDS进行基因诊断研究，并获得满意的结果［1］。在此基础上，笔者设计并合成两对引物，以MDS、再生障碍性贫血(AA)和原发性血小板减少性紫瘢(ITP)等患者骨髓细胞DNA为模板进行PCR基因诊断研究，发现其中一对引物适用于约90%的MDS－RA和可疑RA的基因诊断以及同其他已知贫血出血病的鉴别诊断。现将结果报道如下。

材料与方法

1．病例:MDS－RA 19例，可疑 RA 13例，RAEB(T)13例;AA 17例，可疑AA 4例;ITP 15例;溶血性贫血(HA)2例;红血病，PNH，α－地中海贫血和巨幼细胞性贫血(MA)各1例;AL和恶性肿瘤8例;慢粒和真性红细胞增多症(PV)3例，共98例。正常人8人。32例MDS中男性24例，女性8例。患者年龄16～69岁，平均年龄44岁。可疑RA指RA/AA，RA/HA或RA/ITP。而可疑AA指AA/RA。细胞遗传学研究支持可疑RA为早RA，而可疑AA为早AA［2］。此类病例随访结果证实了这一点。上述病例均由笔者医院血液内科诊断，其中大多数为住院患者。

2．方法:(1)PCR方法:①骨髓细胞模板DNA的提取:用小刀将患者骨髓涂片上的细胞刮下来，收集于1．5ml EP管内，加入 TEN(15mmol/L Tris，15mmol/L EDTA，15mmol/L Nacl，pH8．0)液 500μl，10%SDS 75μl，蛋白酶 K(2．0mg/ml)10μl，于55℃水浴中孵育5h，其余步骤与文献［1］相同;②聚合酶链反应(PCR)条件:模板变性条件为97℃ 7min，32个循环，每个循环中变性条件为 94℃ 5min，退火条件为52℃1min，延伸条件为72℃ 2min，最后一次循环之后延伸时间为5min，取出置于4℃保存;③PCR产物的检测:1．8%琼脂糖凝胶电泳，每孔点样品(PCR 产物)10μl，60V，30mA，电泳 20～25min，EB染色，紫外线灯下观察结果。(2)原位杂交(ISH)方法(采用宝灵曼公司DIG－标记及检测试剂盒):①骨髓穿刺标本4ml于肝素管中抗凝，经淋巴细胞悬液离心收集于EP管中，－20℃保全，以备提取DNA用;②V－erbB Oligo探针标记:杂交前细胞涂片的予处理，予杂交和杂交，杂交后的洗涤和检测等均按试剂盒的要求进行;③结果观察:显微镜下计数200个有核细胞。细胞核内出现棕褐色斑点为阳性反应。若阳性反应小于细胞核面积的1/4时计为“+”;阳性反应大于核细胞面积的1/4而小于或等于细胞核面积的2/4时计为“++”;小于或等于细胞核面积的3/4时，计为“+++”;阳性反应大于细胞核面积的3/4时，计为“++++”。对上述病例作V－erbB PCR和ISH检测的同时，每例均作骨髓细胞遗传学(包括核型分析和SCD检测)检查，其方法见参考文献［2］。

结 果

1．PCR检测结果:对32例 MDS和12例可疑MDS作PCR检测结果如下:①RA和可疑RA有其特殊的PCR产物电泳带型即4条大小不同的条纹(图1);②典型AA和ITP均无带纹;③可疑AA有1～2条带，与早期红血病相似;④少数ITP和HA有1～2条带纹;⑤正常人和MA无带。其他贫血病和出血病均无此带型。表明其高度的特异性，详见表1。

图1 患者骨髓V－erbB PCR检测结果

表1 44例MDS和可疑MDS患者骨髓检查结果

2．原位杂交检查结果:对37例MDS(包括转白血病者)，3例可疑MDS和19例对照组(包括8例ITP，7例AA，3例IDA和1例α－地中海贫血)原位杂交检测结果如下:全部 MDS和2例(2/3)可疑MDS呈阳性反应(图2)，对照组仅1例AA有阳性反应。对其中22例MDS和3例可疑MDS同时进行PCR和原位杂交检测，结果17例MDS，2例可疑MDS为两项指标均阳性的病例，阳性率76%，表明两者高度的一致性。

图2 患者骨髓细胞V－erbB Oligos原位杂交(ISH)照片

3．动态观察:对上述7例MDS先后进行两次以上随访检测并做动态观察，同时对MDS各期的原位杂交积分值作t检验，发现杂交信号积分值依次为:RA组 ＜RAEB(T)组 ＜转白血病组(P＜0．001和0.005)。SCD阳性组＜SCD阴性组(P＜0．001)，而核型正常组与异常组无统计学差异。说明随着MDS转为白血病，其原位杂交积分值呈显著性增加。这一点亦同原位杂交积分值与MDS患者骨髓原始和早幼粒细胞百分率的增加(P＜0．001)，和骨髓细胞SCD转阴的结果相一致。表明原位杂交结果不仅有诊断意义还有白血病发病学意义。

讨 论

如上所述，应用现有这对引物PCR，约75%MDS呈阳性反应。扣除+8病例，其阳性率高达87.5% ～91．6%。说明这对引物适用于大多数MDS基因诊断。尽管MDS与早期红血病和良性代偿性增生骨髓有相同PCR产物电泳带纹(1～2条带)，但后两者均未见MDS－RA带型(4条带)，其临床意义十分明显。至于+8 MDS PCR阴性的原因值得研究。国际上曾有2名作者应用V－erbB探针作Southern印迹杂交，先后对3例t(1;7)MDS进行分析，其中1人曾获得阳性结果(仅见C－erbB扩增，不见重排);另1人未能取得阳性结果，因而无从建立PCR基因诊断法［3］。

本文1例可疑RA骨髓细胞核型46XX，病理检查支持RA诊断。其V－erbB PCR结果显示RA带型(图1)从而确认其RA诊断。患者经两年余服用康力龙等雄性激素后骨髓象血象恢复正常至今已5年。在同一批PCR实验中，对其治疗前后骨髓细胞DNA进行检测，结果治疗后其RA带型消失。这一结果为其病情恢复正常提供了有力证据。笔者曾发现1例RA经相同的治疗后恢复正常。其原有的C－erbB重排/扩增消失。说明RA和早RA激素逆转正常是完全可能的［4］。而笔者所建立的V－erbB PCR基因诊断法则为此提供了简便易行的检测手段。

针对上述两条有诊断和发病学意义的Oligos，笔者设计并合成两条反基因Oligos，经磷酸硫代修饰后，尾静脉注射对16只大鼠 MDS(其中15只为RAEB)进行基因治疗研究。注射后2～3个月内15只病鼠骨髓象恢复正常，血象亦基本正常［5，6］。这一结果有力地说明，上述正义Oligos经地高辛标记作骨髓细胞原位杂交结果确有诊断和发病学意义。

1 冯宝章，雷健玲，王海青，等．骨髓增生异常综合征(MDS)基因诊断和发病原理研究［J］．中华肿瘤杂志，1995，17(增刊):159

2 冯宝章，雷健玲，刘焕勋，等．骨髓增生异常综合征(MDS)和再生障碍性贫血(AA)等细胞遗传学研究［J］．中华内科杂志，1994，33:754

3 Woloschak GE，Dewald GW，Bahn RS，et al．Amplification of RNA and DNA specific erbB in unbalanced 1;7 chromosomal translocation associated with myelodysplastic syndrome［J］．Journal of Cellular Biochemstry，1986，32:23 －34

4 冯宝章，雷健玲，杨崇礼，等．白血病前期基因诊断并激素逆转成功1例［J］．中华内科杂志，1992，31(9):539 －542

5 冯宝章，雷健玲，林泽嬉，等．大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)基因治疗研究［J］．中国癌症研究进展，1998，99:171－175

6 冯宝章，雷健玲，林泽嬉，等．大鼠骨髓增生异常综合征基因治疗及其机制研究［J］．医学研究杂志，2010，39(3):129 －131