类风湿关节炎患者血浆sHLA－G表达及其与Treg细胞的相关性研究

侯 丽 沈 波 郑玉芬 郑 静 朱 敏

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，滑膜炎持久反复发作，继而侵犯骨组织，造成关节软骨、骨和关节囊的破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。其病因和发病机制至今尚未完全清楚，目前已有研究表明遗传、环境及免疫调节在RA的发病中具有极为重要的作用，特别是免疫紊乱与RA的发生发展密切相关。人类白细胞抗原－G(human leukocyte antigen G，HLA－G)是近年发现的自身免疫负调控的重要靶标，在免疫调节及免疫耐受的维系中发挥重要作用。研究发现，HLA－G不仅可通过与多种免疫活性细胞上的抑制性受体结合直接发挥免疫抑制的作用，还可以通过各种途径诱导产生调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，间接发挥免疫抑制作用，其异常表达可导致自身免疫耐受缺失或炎症紊乱［1，2］。而HLA－G在RA中的功能和作用机制研究还刚起步，因此，本研究通过ELISA法检测RA患者血浆sHLA－G水平，流式细胞术检测外周血CD3+HLAG+T细胞、Treg细胞含量，分析三者表达变化及其相关性及与RA临床特征的关系，以探讨它们在RA发病过程中的可能作用，从而进一步加深对RA发病机制的认识，为RA免疫干预策略提供新的靶向。

材料与方法

1．临床资料:40例RA患者均系温州医科大学附属浙江省台州医院2013年1～5月期间就诊的患者，诊断均符合美国风湿病协会1987年修订的RA分类诊断标准［3］，其中男性17例，女性23例，患者年龄37～80岁，平均年龄57．8±11．0岁。详细收集患者的临床资料，包括症状、体征及实验室检查结果等。40例健康对照者均来自浙江省台州医院体检中心的健康体检者，其中男性15例，女性25例，年龄27～79岁，平均年龄51．8±10．9岁。RA患者组与健康对照组年龄及性别均无差异。该临床资料获取所遵循程序符合负责人体试验委员会所制定的伦理学标准，并取得受试对象的知情同意。

2．DAS28评分:DAS28评分参照 Prevoo等［4］的计算方法，即:DAS28=0．56×压痛关节数+0．28×肿胀关节数 +0．7×ln(红细胞沉降率，ESR)×1．08+0．16。DAS28以 28个关节计分:包括双肩、双肘、双腕、双手掌指关节、双手近端指间关节、双膝关节。DAS28＞5．1表示高疾病活动度，3．2＜DAS28＜5．1表示中疾病活动度，2．6＜DAS28＜3．2表示低疾病活动度，DAS28＜2．6表示疾病缓解。

3．标本采集:分别抽取两组研究对象清晨空腹静脉血2ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，流式细胞术检测CD3+HLA－G+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量后，将剩余全血离心后分离血浆放－20℃保存。

4．主要试剂和仪器:抗人CD4－异硫氰酸荧光素(FITC)抗体、CD25－别藻青蛋白(APC)抗体、CD3－FITC抗体以及FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，抗人Foxp3－藻红蛋白(PE)抗体及其同型对照抗体、Foxp3固定/破膜工作液(Foxp3 Staining Buffer Set)、抗人HLA－G－PE抗体及其同型对照抗体(美国eBioscience公司);HLA－G5酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(捷克共和国BioVendor公司)。

5．ELISA方法检测血浆sHLA－G表达水平:具体步骤严格按照试剂盒步骤进行。读取血浆样本的吸光度值，根据标准曲线计算样本浓度。

6．流式细胞术检测CD3+HLA－G+T细胞:标本管加入10μl CD3－FITC抗体和5μl HLA－G－PE抗体，对照管加入10μl CD3－FITC抗体和5μl同型对照抗体IgG2a －PE后，加入EDTA抗凝血100μl，混匀后室温避光孵育15min，加溶血素2ml，混匀室温避光10min，1000r/min离心6min后弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入0．5mlPBS重悬细胞后立即上机检测。

7．流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞:每管加入10μl CD4－FITC抗体和10μl CD25－APC抗体后加入EDTA抗凝血100μl，混匀后室温避光孵育20min，加溶血素2ml，混匀，室温避光10min，1000r/min离心6min后弃上清，PBS洗涤1次，加入1ml固定/透膜剂，震荡混匀，4℃避光孵育50min，透膜剂清洗液洗涤1次，用100μl透膜剂清洗液重悬细胞后标本管加入10μl Foxp3－PE抗体，对照管加入10μl同型对照抗体IgG1－PE，震荡混匀，4℃避光孵育50min，透膜剂清洗液洗涤2次，加入0．5mlPBS重悬细胞后立即上机检测。

8．统计学方法:数据用SPSS 17．0版统计软件进行处理，检测结果用均数±标准差(±s)或中位数(M)和四分位数间距(Q25～Q75)表示。计量资料组间比较根据数据分布类型分别采用独立样本t检验、非参数Mann－Whitney U检验，不同指标间的相关性用Spearman分析。P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1．RA患者血浆sHLA－G的表达及其与疾病的相关性:RA组血浆sHLA－G水平与健康对照组相比显著降低，差异具有统计学意义［36．41(28．28～80.87)U/ml vs 50．44(38．52 ～ 59．62)U/ml，P ＜0.001，图1］。将RA患者血浆sHLA－G水平与疾病活动度及RA各相关抗体进行相关性分析，发现sHLA－G水平与DAS28评分呈显著负相关(r=－0．514，P=0．0007，图 2)，而与 RF、ESR、CRP、抗CCP抗体和ANA水平等均无明显相关性(P＞0.05)。

图1 RA组与健康对照组血浆sHLA－G水平的比较

2．RA患者外周血CD3+HLA－G+T细胞的表达分析:RA患者外周血CD3+HLA －G+T细胞百分比较健康对照组明显降低［1．05%(0．44% ～2．15%)vs 2.39%(1．09% ～5．52%)，P ＜0．001，图 3］，差异具有统计学意义。此外，RA患者外周血CD3+HLAG+T细胞百分比与患者DAS28评分显著负相关(r=－0．395，P=0．011，图 4)，但未发现 RA 患者 CD3+HLA－G+T细胞百分比与RF、ESR、CRP、抗CCP抗体和ANA水平等存在明显相关性(P＞0.05)。

图2 RA患者血浆sHLA－G水平与DAS28评分的相关性分析

图3 RA组与健康对照组外周血CD3+HLA－G+T细胞百分比的比较

图4 RA患者外周血CD3+HLA－G+T细胞百分比与DAS28评分的相关性分析

3．RA患者外周血Treg细胞的表达及其与HLA－G水平的相关性:实验结果表明，RA患者外周血Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞)百分比较健康对照组明显降低［3．25%(2．31% ～4．75%)vs 4．47%(3．66% ～6．30%)，P ＜0．01，图 5］。另外，对RA患者外周血Treg细胞百分比与sHLA－G水平和CD3+HLA－G+T细胞百分比进行相关性分析，结果显示，Treg细胞百分比与sHLA－G水平存在明显相关性(r=0．407，P=0．009，图 6)，而 Treg 细胞百分比与CD3+HLA－G+T细胞百分比无明显相关性(r=0.203，P=0．208)。

图5 RA组与健康对照组外周血Treg细胞百分比的比较

图6 RA患者sHLA－G水平与Treg细胞百分比的相关性分析

讨 论

近年研究表明HLA－G分子在母胎免疫、器官移植、肿瘤以及慢性炎症性疾病的免疫耐受中发挥重要作用［5～7］。HLA－G是机体内一个重要的免疫调节分子，具有mHLA－G(HLA－G1－G4)和sHLAG(HLA－G5－G7)两种表达方式。mHLA－G与sHLA－G分子在功能上有着相似的抑制机体免疫活性细胞的生物学作用，它们主要通过与表达靶细胞表面的特异性受体 ILT2、ILT4、KIR2DL4 等结合［8］，传递抑制信号，发挥免疫调节的功能，如抑制CD4+T细胞的增殖和干扰原始CD4+T细胞对Th1/Th2、Th17/Treg细胞的分化。诱导活化的CD8+T细胞和CD8+NK细胞发生凋亡，抑制细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的细胞杀伤活性，抑制树突状细胞(DC)等的抗原递呈作用等［1］。此外，HLA－G还可通过各种途径诱导产生Treg细胞，进而发挥免疫抑制作用。Selmani等［2］体外研究发现，由人骨髓间充质干细胞分泌的HLA－G5可诱导T细胞分化成CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞。另外，经HLA－G诱导的致耐受DC细胞又能诱导T细胞分化成CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。而Treg细胞可通过细胞间直接接触和分泌抑制性细胞因子(如IL－10、TGF－β)等途径发挥其免疫抑制的功能。因此，HLA－G的表达及其诱导产生Treg细胞的潜在作用对维持机体免疫自稳，防止自身免疫性疾病具有极其重要的作用。故我们探讨其在RA中的临床应用价值。

事实上，已有研究报道，RA患者血清sHLA－G浓度显著低于对照组，但血清sHLA－G浓度与RA炎症活度度指标呈正相关［9］。而 Rizzo等［10］对早期RA患者进行研究，发现早期RA患者血浆sHLA－G水平亦对照组显著降低，且血浆sHLA－G水平与RA的炎症活动度指标负相关。这些都表明sHLA－G的异常表达可能与RA的发生发展密切相关。在本研究中，笔者通过ELISA法检测，发现RA患者血浆sHLA－G水平比健康对照组明显降低。同时，通过流式细胞术检测发现RA患者外周血CD3+HLAG+T细胞百分比也较对照组明显降低，说明RA患者外周血中可能不仅存在sHLA－G的表达降低，还存在mHLA－G的表达降低，而且可能正是因为这些分子表达数量上的缺失，导致了机体免疫抑制功能的低下，从而使T细胞、NK细胞、DC细胞等各种免疫细胞异常活化，细胞亚群平衡失控，给RA的发生发展创造了条件。

另外，笔者还对RA患者sHLA－G水平及CD3+HLA－G+T细胞含量与RA疾病活动度DAS28评分及各临床指标进行了相关性分析。结果显示，RA患者sHLA－G水平和CD3+HLA－G+T细胞百分比均与患者DAS28评分呈显著负相关，提示疾病活动度越高的患者，可能HLA－G分子表达降低越明显，从而导致患者病情越严重。另外，HLA－G具有抗炎和免疫抑制的功能，因此这些分子的存在可能会影响疾病的活动性。但是，未发现RA患者sHLA－G水平及CD3+HLA－G+T细胞百分比与 RF、ESR、CRP、抗CCP抗体和ANA水平等存在明显相关性，可能与样本数量不够等因素有关，具体的关系还有待于进一步深入研究。

越来越多的研究表明，RA患者体内存在Treg细胞数量减少和(或)功能降低，提示Treg细胞的异常与RA的发生发展密切相关［11］。近年，HLA－G表达与Treg细胞之间的关系受到人们的广泛关注，二者之间的相关性已在肿瘤［6］、器官移植等多种疾病中得到证实，但关于HLA－G与Treg细胞在自身免疫性疾病中的相互关系尚无研究报道。笔者的研究发现RA患者外周血Treg细胞百分比较对照组明显降低，与之前研究结果一致。同时，为了更好的分析RA患者外周血Treg细胞水平与HLA－G表达之间相关性，笔者分别对RA患者Treg细胞百分比与sHLAG水平和CD3+HLA－G+T细胞百分比进行相关性分析，结果显示，Treg细胞百分比与sHLA－G水平存在明显正相关性，而与CD3+HLA－G+T细胞百分比可能存在正相关，但结果显示差异无统计学意义，表明HLA－G与Treg细胞在RA免疫负调节的作用中具有明显相关性。由此，笔者推测HLA－G和Treg细胞之间可能存在相互诱导和调节的信号途径，并对诱导和维持机体自身免疫耐受起着重要的协同作用，而这种协同作用可能主要表现在sHLA－G与Treg细胞之间，其中关于其内在的具体机制和调节因素还有待于进一步深入研究。

综上所述，笔者的研究结果表明，RA患者血浆sHLA－G水平及外周血T细胞表达mHLA－G异常降低，提示RA患者体内免疫抑制功能低下，从而导致各种炎症细胞逃避死亡，细胞异常活化和细胞亚群的平衡失控等，极大促进RA的发生发展。目前国内外尚无HLA－G与Treg细胞在RA中的相关性研究，而笔者的研究发现RA患者sHLA－G水平与Treg细胞百分比呈显著正相关，由此推测HLA－G分子和Treg细胞之间可能存在相互诱导和调节的信号途径，并对诱导和维持机体自身免疫耐受起着重要的协同作用，因此，进一步深入研究和阐明其相关信号通路及具体机制有助于理解RA的发病机制及为RA免疫干预策略提供新的靶向。

1 Yan WH．HLA －G expression in cancer:potential role in diagnosis，prognosis and therapy［J］．Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2011，11(1):76－89

2 Selmani Z，Naji A，Zidi I，et al．Human leukocyte antigen － G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25highFoxp3+regulatory T cells［J］．Stem Cells，2008，26(1):212 － 222

3 Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al．The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，1988，31(3):315 －324

4 Prevoo ML，Van't Hof MA，Kuper HH，et al．Modified disease activity scores that includes twenty－eight joint counts development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，1995，38(1):44 －48

5 Menier C，Rouas－Freiss N，Favier B，et al．Recent advances on the non－classical major histocompatibility complex class I HLA－G molecule［J］．Tissue Antigens，2010，75(3):201 － 206

6 Chen HX，Lin A，Shen CJ，et al．Upregulation of human leukocyte antigen－G expression and its clinical significance in ductal breast cancer［J］．Hum Immunol，2010，71(8):892 －898

7 Monsiváis－Urenda AE，Baranda L，Alvarez－Quiroga C，et al．Expression and functional role of HLA－G in immune cells from patients with systemic lupus erythematosus［J］．J Clin Immunol，2011，31(3):369－378

8 Pistoia V，Morandi F，Wang X，et al．Soluble HLA －G:are they clinically relevant?［J］．Semin Cancer Biol，2007，17(6):469 －479

9 Verbruggen LA，Rebmann V，Demanet C，et al．Soluble HLA －G in rheumatoid arthritis［J］．Hum Immunol，2006，67(8):561 － 567

10 Rizzo R，Farina I，Bortolotti D，et al．HLA － G may predict the disease course in patients with early rheumatoid arthritis［J］．Hum Immunol，2013，74(4):425 －432

11 Anderson AE，Isaacs JD．Tregs and rheumatoid arthritis［J］．Acta Reumatol Port，2008，33(1):17 －33