乳腺癌相关基因异常甲基化研究进展及其临床应用

吴 亮 王建明

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，目前关于乳腺癌生物标志物的研究很多，如ER、PR、HER－2等已广泛应用于治疗方案筛选，但用于特异性诊断的生物标志物还很匮乏。尽管国内外研究者正积极探索新的蛋白类生物标志物，但难以突破发展和应用中的瓶颈，即特异性抗体制备和定量检测困难。因此，寻找新型的特异性生物标志物是实现包括乳腺癌在内的多种肿瘤早期诊断的当务之急。

随着分子生物学领域研究的深入，人们发现DNA序列以外的调控异常在肿瘤发生、发展过程中更为普遍，这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控称为表观遗传改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因印迹以及microRNA调控等［1］。与遗传因素不同的是，表观遗传受环境因素控制，其改变是可逆的。作为一种潜在分子生物标志物和药物靶点，表观遗传学在肿瘤防治领域日益受到重视，其主要形式之一即DNA甲基化。

DNA甲基化是肿瘤发生的早期事件，在肿瘤发生发展中起着重要作用［2］。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，以S－腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C－5位、腺嘌呤的N－6位、胞嘧啶的N－4位或鸟嘌呤的N－7位等。在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在富含CpG岛的基因启动子区［3］。该区的CpG岛发生甲基化后可导致基因转录受抑，蛋白表达减少，相应的生物学功能下降甚至丧失。肿瘤发生时，一般呈现全基因组低甲基化而特异基因超甲基化的现象。现已确认的超甲基化基因大多是抑癌基因，如乳腺癌中常见的超甲基化基因包括细胞周期调节、细胞凋亡、DNA修复、激素调节、细胞黏附和侵袭、血管生成等基因。

一、乳腺癌特异性位点DNA异常甲基化

近年来研究发现，多种基因在乳腺癌组织发生了异常甲基化。

1．BRCA1基因:1990年Hall等研究发现，染色体17q21与早期发生的家族性乳腺癌有关，1994年Miki等成功克隆了第1个与家族性乳腺癌和卵巢癌相关的基因，命名为BRCA1。BRCA1基因的可遗传性突变是约50%遗传性乳腺癌的主要分子机制，但在散发性乳腺癌中BRCA1基因的突变频率并不高。目前已证实DNA甲基化所致的BRCA1基因失活是乳腺癌发生中的一个重要事件，而且与患者预后有关［4，5］。

2．Cyclin D2基因:Cyclin D2是D型细胞周期素的成员之一，在细胞周期中通过调控细胞周期素依赖蛋白激酶Cdk4和Cdk6的活性参与G1期到S期的过渡。Evron等(2001年)观察到近半数的原发性乳腺癌病例组织中检测到该基因启动子区呈高甲基化，且与Cyclin D2 mRNA和蛋白表达缺失。

3．SFRP1基因:分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因是Wnt信号通路的抑制剂，通过干扰配体－受体间的相互作用而阻断Wnt信号通路。Jeong等［6］利用焦磷酸测序技术分析60例乳腺癌组织，发现基底细胞样亚型乳腺癌SFRP1甲基化水平显著降低，提示该基因异常甲基化可作为表观遗传标志物和乳腺癌预后因子。

4．CDH1基因:又称E－钙黏蛋白基因，编码的E－钙黏蛋白(E－cadherin)是一种跨膜糖蛋白，属于细胞黏附分子家族，介导相邻的上皮细胞间依赖钙的细胞连接，对于维持细胞分化、极性和正常组织结构起重要作用。Caldeira等［7］应用MSP技术发现浸润性乳腺癌患者CDH1基因高甲基化与雌激素受体ER低表达有关。Sebova等［8］发现CDH1基因甲基化水平的差异在不同淋巴结状态亚组和不同免疫组化亚组中均有统计学意义，提示高甲基化的CDH1基因可以为识别潜在转移性肿瘤提供依据。

5．APC基因:结肠癌瘤性息肉病基因(APC)由Herrera于1986年在1例格德纳综合征患者中发现。正常情况下具有多种功能，如抑制细胞生长及促进细胞凋亡、调节细胞迁移和Wnt信号转导等。Swift－Scanlan等［9］发现APC甲基化频率随乳腺癌分期和肿瘤大小增长而增加，与不良预后结局有关，同时也发现APC甲基化与ER+、HER－2+乳腺癌有关，有望作为区分ER阳性与否以及癌细胞侵袭性强弱的标志。

6．RASSF1A基因:Dammann等(2000年)用酵母双杂交筛选方法从染色体3p21．3克隆出与RAS效应蛋白Maxp1、Nore1高度同源的基因RASSF1，命名为RAS相关结构域家族1基因，其中RASSF1A是主要的转录本之一。Xu等［10］通过焦磷酸测序法发现RASSF1A启动子甲基化与肿瘤复发和总生存期有关。Jiang等［11］发现RASSF1A基因启动子高甲基化使乳腺癌患者癌症复发及预后不良的风险增高，提示RASSF1A启动子甲基化可能是乳腺癌的潜在预后指标。

二、乳腺癌全基因组异常甲基化

随着研究的深入，科学家们致力于发现全基因组范围内未知的甲基化位点。与特异性位点甲基化检测相比，全基因组甲基化分析可以帮助我们广泛、深入地寻找异常甲基化位点并探索其临床应用价值。在单个基因甲基化没有或者只有较弱的临床预后意义的情况下，多基因甲基化标志物的联合应用则可有效预测患者治疗后的生存期长短。

Toyota等(1999年)在大肠癌的研究中发现，一些病例同时存在多个基因的异常甲基化，称为 CpG岛甲基化表型(CIMP)。CIMP涉及多个基因启动子同时甲基化，具有肿瘤特异性，与多种肿瘤的发生或预后相关。Fang等［12］通过DNA微阵列杂交技术在乳腺癌研究中发现CIMP+肿瘤发生转移的可能性低于CIMP－肿瘤，并且有较好的临床结局。

Holm 等［13］使用 Illumina Golden Gate Methylation Cancer Panel检测了807个基因的CpG位点，发现甲基化状态与腺腔A型、腺腔B型、基底细胞样型乳腺癌有关联，其中腺腔B型乳腺癌的甲基化程度最高，而基底细胞样型最低，提示不同乳腺癌分子亚型与乳腺组织中特异DNA甲基化存在关联。

全基因组甲基化研究还发现谱系特异性甲基化现象。Sproul等［14］使用27k Infinium arrays研究了19个乳腺癌细胞系和49例原发性乳腺癌患者的14000多个基因，他提出乳腺癌DNA甲基化是细胞谱系而不是肿瘤进展的标志，同时也强调识别肿瘤特异性甲基化对未来乳腺癌的诊断和治疗至关重要。

三、外周血游离DNA甲基化检测

大多数DNA甲基化检测需要组织标本，在临床应用上具有一定困难。作为早期诊断或预后的潜在标志物，需要一种简单、可靠、非侵袭性的检测手段。20世纪40年代后期，Mandel和Metais首先在体循环中发现游离核酸。怀孕、外伤和器官移植后的健康人和癌症患者体循环中游离DNA量较大，其分子大小在500bp～30kb之间。早在1977年Leon等就发现肿瘤患者血液循环中游离DNA的水平显著高于正常人，且可检测到肿瘤特异性DNA改变。之后在肺癌患者的痰液、膀胱癌和前列腺癌患者的尿液、众多类型癌症患者的血浆/血清中均发现DNA异常甲基化。循环DNA的遗传及表观遗传学改变模式与同一个体癌灶组织细胞的DNA基本一致，且血清比血浆含量更多［15，16］。游离DNA简便、微创的取材方式及其与疾病的高度相关性使其具有广泛的临床应用价值。人外周血循环DNA量和质的改变与疾病发生发展关系密切，有希望成为疾病诊断、疗效评估及预后预测的一种重要分子标志物。但由于游离DNA的含量较低，提取比较困难，游离DNA的检测方法不一，各自敏感度差异较大，特异性低，易发生假阴性，检测方法还需进一步改进。

越来越多的研究证实肿瘤患者血清中有高水平的肿瘤特异性DNA改变，其中90%以上为来源于肿瘤组织的游离循环DNA，但血清中DNA含量很少，需要非常灵敏的检验方法［17～19］。Radpour等利用SEQUENOM's Epi TYPER技术分析了10个候选基因(APC、BIN1、BMP6、BRCA1、CST6、ESR － b、GSTP1、P16、P21、TIMP3)甲基化谱，结果发现，患者外周血循环DNA的甲基化模式与乳腺癌组织的甲基化模式高度一致，采用其中8个基因构建的DNA甲基化文库已足以区分正常乳腺组织与乳腺癌组织，敏感度和特异性均达90%以上［16］。其他实验方法，如基于限制性内切酶的方法(RLGS、Ms－AC－PCR等)、基于免疫的方法(MeDIP)、基于亚硫酸氢盐转化的方法(MSP、MS－HRM、Methylight)等已被用于游离 DNA甲基化检测。

四、针对DNA异常甲基化的临床治疗应用

过去几十年间，乳腺癌分子生物疗法有了迅速发展，对于雌激素受体阳性患者可采用选择性雌激素受体调节剂(SERMs)如他莫昔芬，芳香酶抑制剂(AIs)如阿那曲唑，选择性雌激素受体下调剂(SERDs)如氟维司群。针对雌激素受体阴性乳腺癌患者则可先恢复其ESR1(雌激素受体α)基因表达，重建雌激素对肿瘤细胞生长的调控，再使用抗雌激素药物治疗［20］。

越来越多证据表明内分泌疗法相关的雌激素受体通路与表观遗传机制有关［21］。与基因突变不同，表观遗传修饰是可逆的，因此该领域的研究有望拓展乳腺癌治疗方法。对乳腺癌细胞系研究发现，DNA甲基转移酶抑制剂可恢复ESR1的表达［22］。也有研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂也可以再活化雌激素受体阴性细胞系的受体表达［21］。Michaud等在1994年研究小鼠Avy等位基因时发现，营养成分可以调节哺乳动物细胞表观遗传状态，利用植物以及一些植物的天然产物来预防及治疗各种癌症引起了人们极大的兴趣［23］。

目前可用于治疗乳腺癌的甲基化转移酶抑制剂如阿扎胞苷、地西他滨等尚存在诸多不足，它们大部分具有高毒性且缺乏基因特异性，非特异性的脱甲基还具有引起抑癌基因沉默的风险。食物的生物活性成分制剂也有缺点，例如从绿茶中提取的生物活性物质——表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)在生理条件下非常不稳定，姜黄中的姜黄素几乎不溶于水，很难被胃肠道吸收［4］。尽管存在这些问题，利用天然膳食中的生物活性成分来预防和治疗肿瘤仍具有广阔的应用前景。

DNA甲基化作为一个新兴研究领域，在临床应用方面的价值日益受到重视，但缺乏简便、灵敏、特异的检测方法，仍是制约其广泛应用的瓶颈［24］。DNA甲基化仅是表观遗传学改变的一部分，我们期待能更深入地了解乳腺癌表观遗传学改变，如组蛋白修饰、MicroRNA等。现阶段乳腺癌表观遗传学研究虽然未能完全解释乳腺癌的发生机制，但随着研究深入和分子生物学技术的发展，必将涌现出更多、更完善的检测和分析方法，为表观遗传学研究提供强有力的技术支持。

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