柱前衍生化RP－HPLC测定铁皮石斛鲜品中的氨基酸的含量

鲁芹飞 毕何锋 林 培 李 妹 邓路平 黄 松

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，兰科石斛属植物，有滋阴益胃、清热生津、益智安神、强精壮骨之功效，一直以来，被视为名贵药材［1］。目前对铁皮石斛的研究多集中在多糖方面，氨基酸方面的研究相对较少，有关铁皮石斛氨基酸类成分的含量分析均是使用氨基酸分析仪，因为其局限性，限制了氨基酸的研究［2～6］。近年来柱前衍生反相高效液相色谱法分析氨基酸技术有了广泛应用，相应的促进了氨基酸的进一步研究［7～12］。目前常用的柱前衍生剂有:邻苯二甲醛(OPA)、氯甲酸芴甲酯(FMOCCl)、异硫氰酸苯醋(PITC)、丹酰氯(Dansyl－Cl)等。近些年，铁皮石斛除了常规的作为药物应用，铁皮石斛的鲜品越来越多的被作为保健食品应用。本实验采用PITC作为柱前衍生剂结合反相高效液相色谱技术测定了铁皮石斛鲜品药材中游离氨基酸的含量，以期为铁皮石斛中氨基酸的深入研究做好基础，同时为铁皮石斛鲜品的综合应用提供科学依据。

材料与方法

1．材料:(1)药品与试剂:15种氨基酸对照品(中国药品生物制品检定所购买，编号为:624－200104);PITC衍生剂(色谱纯，美国Sigma公司);乙腈(色谱纯，德国Merck公司);其他试剂均为分析纯;5批铁皮石斛鲜品药材由广东永生源生物科技有限公司提供，经广州中医药大学陈建南研究员鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，标本存放于广州中医药大学新药开发研究中心。(2)实验仪器:SHIMADZU高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD－20A紫外可见光检测器，Sartorius BP110S电子天平(德国);Sartorius CP225D电子天平(德国);Aquapro艾科浦u系列纯水机;KQ3200DE型医用数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司);EYELA M－旋转蒸发仪(日本)，SHZD(Ⅲ)循环水式真空泵。

2．方法:(1)色谱条件:CAPCELL PAK C18 SG300色谱柱(250mm ×4．6mm，5μm)，流动相 A 为乙腈:0．05mol/L 醋酸钠=1∶1，流动相 B 为 0．05mol/L 醋酸钠(pH 值 6．5)，检测波长254nm，流速为0．6ml/min，室温。流动相梯度条件见表 1。(2)对照品溶液的制备:精密称取15种氨基酸对照品［天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、蛋氨酸(Met)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)］各 20mg，分别置于 10ml容量瓶中，加0．1mol/L盐酸使其溶解，并定容至刻度，即得15种氨基酸单一对照品溶液。分别精密移取谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸对照品溶液各2．0ml，置25ml容量瓶中，加 0．1mol/L盐酸稀释至刻度，即得氨基酸混合标准品－1。分别精密移取酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸对照品溶液各2．0ml，置25ml容量瓶中，加0．1mol/L盐酸稀释至刻度，即得氨基酸混合标准品－2。分别精密移取氨基酸混合标准品－1、氨基酸混合标准品 －2各1．0ml，置10ml离心管中，精密加入1．0mol/L三乙胺乙腈溶液、0．1mol/L PITC乙腈溶液各2．0ml，涡漩混匀1min，室温下放置60min，加正己烷4ml，涡漩混匀1min，室温下放置10min，弃去上层正己烷层，反复萃取3次，移取下层溶液置5ml容量瓶中，用0．05mol/L醋酸钠溶(pH值6．5)定容至刻度，微孔滤膜(0．22μm)过滤，进样10μl。(3)供试品溶液(1号样品)的制备:取铁皮石斛鲜品样品2．0g，剪成不超过3mm的小段，研碎，混合均匀，分别加70%乙醇40ml超声提取2次，每次40min，合并滤液，减压回收溶剂至干，0．1mol/L盐酸溶解，转移到5ml容量瓶中，加0．1mol/L盐酸稀释至刻度。取2．0ml供试品溶液置10ml离心管中，按“对照品溶液的制备”项下方法自“精密加入1.0mol/L三乙胺乙腈溶液”起操作，即得。(4)空白溶液的制备:取0.1mol/L盐酸溶液5ml，按“对照品溶液的制备”项下方法自“置10ml离心管中，精密加入1．0mol/L三乙胺乙腈溶液”起操作，即得。(5)专属性考察:取衍生后的混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各10μl，按“色谱条件”项下色谱条件进样。(6)线性关系的考察:精密吸取衍生后的对照品溶液 1、5、10、15、20、25μl，注入高效液相色谱仪中，按“对照品溶液的制备”项下的色谱条件测定，记录色谱峰面积。(7)精密度试验:取“对照品溶液的制备”项中衍生后的混合标准品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录15种氨基酸的峰面积，15种氨基酸的RSD皆小于3．0% 。(8)稳定性试验:取“供试品溶液(1号样品)的制备”项下的供试品溶液，按上述色谱条件分别于 0、4、6、8、12、24h 进样，测定峰面积，15 种氨基酸的RSD皆小于3．0%。(9)重复性试验:精密称取同一批样品6份，每份约2．0g。按“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，依上述色谱条件进样测定，计算各氨基酸含量，15种氨基酸的 RSD皆小于3．0%。(10)加样回收试验:精密称取已知含量的样品6份各1．0g，剪成不超过3mm的小段，研碎，混合均匀，再分别加入氨基酸混合标准品－1和混合标准品－2各500μl，按“供试品溶液(1号样品)的制备”项下的方法自“分别加70%乙醇40ml超声提取2次，每次40min”起操作，制备所需溶液，按上述色谱条件进样测定，计算回收率。15种氨基酸的平均回收率为94．3% ～104．7%，除 Asp、Met、Phe的 RSD大于3.0%外，其余 12种氨基酸的RSD皆小于3．0%。(11)样品测定:取按“供试品溶液的制备”项下的方法制备的样品溶液15μl，按照上述的色谱条件进行测定。

表1 流动相梯度条件

结 果

1．专属性考察结果:15种氨基酸色谱峰分离度良好，空白无干扰，见图1。

图1 对照品(A)、样品(B)和空白(C)HPLC色谱图

2．线性关系考察结果:以进样量为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得15种氨基酸的回归方程，详见表2。

表2 15种氨基酸的回归方程、相关系数及线性范围

3．样品测定结果:样品测定结果见表3，铁皮石斛5种鲜品中的游离氨基酸主要以天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)为主，占游离氨基酸总量的50%以上。5种鲜品中蛋氨酸(Met)和苯丙氨酸(Phe)含量均较低。

表3 5批鲜品石斛中15种氨基酸含量(mg/g)

讨 论

在对氨基酸进行衍生时，对衍生反应的时间，衍生剂的用量分别进行了考察，发现衍生剂的用量和衍生时间与其他文献［6～9］报道基本一致。故采用较多文献报道的衍生剂的用量和衍生反应的时间。实验测定结果与铁皮石斛干品的氨基酸含量测定结果有一些不同，可能是鲜品在加热干燥过程中，铁皮石斛的氨基酸的转化不同或是部分氨基酸的结构不稳定，遭到破坏，其具体原因有待做进一步的研究探讨。

实验过程中考察了蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇3种不同的提取溶剂，发现50%乙醇和70%乙醇的提取效果较好，而70%乙醇的提取液中几乎不含有多糖，样品的衍生等处理更加便捷，故最终选择了70%的乙醇作为提取溶剂，实验还考查了回流和超声两种提取方式，超声提取效果更好，更加简捷，最后确定了超声提取的方法。

1 李玲，邓晓兰，赵兴兵，等．铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展［J］．肿瘤药学，2011，2:90－94

2 蒋秀美，刘骅，张治国．铁皮石斛和金钗石斛的氨基酸分析［J］．浙江省医学科学院学报，1999，39:26

3 李妮亚，高培元，王紫．海南石斛属和金石斛属植物多糖及氨基酸含量分析［J］．植物资源与环境学报，2004，4:57－58

4 何铁光，苏江，王灿琴，等．铁皮石斛不同来源材料多糖和氨基酸含量的比较［J］．广西农业科学，2007，1:32－34

5 黄民权，阮金月．铁皮石斛氨基酸组分分析［J］．中药材，1997，1:32－33

6 吴庆生，丁亚平，杨道麒，等．安徽霍山三种石斛中游离氨基酸分析［J］．安徽农业科学，1995，3:268－269，271

7 翟旭峰，郭晓蕾，朱龙平，等．柱前衍生化RP－HPLC测定不同产地灵芝中6种氨基酸的含量［J］．中药材，2011，12:1846－1848

8 孙莲，张煊，王岩，等柱前衍生化RP－HPLC测定芜菁子中的12种游离氨基酸［J］．华西药学杂志，2008，4:490－491

9 刘丽敏，王海敏，等．柱前衍生反相高效液相色谱法测定西洋参中游离氨基酸［J］．中成药，2009，2:275－278

10 孙莲，张煊，孟磊，等．柱前衍生RP－HPLC法测定桑叶中16种游离氨基酸的含量［J］．中国药房，2008，36:2830－2832

11 罗晓健，吴志鹏，黄璐琦，等．氨基酸的柱前衍生高效液相色谱分析在中草药研究中的应用［J］．中草药，2005，36(4):630 －632

12 邹秦文，肖新月，程显隆，等．百令胶囊中17种氨基酸的柱前衍生化RP－HPLC法含量测定［J］．药物分析杂志，2010，9:1630－1635