石杉碱甲对D－半乳糖诱导老年性聋的局部抗炎作用

顾 健 李 聪 敖华飞 阮清伟 孔德秋

老年性聋又称年龄相关性听力下降，主要指随着年龄的增长，在排除噪音、耳毒性药物和遗传因素的参与情况下，听觉器官随同身体其他组织器官一起发生的老化过程，主要表现为双耳渐进性对称性的感音神经性听力损失，以高频听力下降为主，伴言语识别率降低等［1］。但迄今为止，老年性聋的防治仍然是尚未解决的难题，近年来最重要的进展是认同氧化应激。石杉碱甲素有“植物中的黄金”之称，已经在临床上用于治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病［2，3］。故本实验组拟通过注射D－半乳糖模拟机体衰老机制制备老年性聋模型，具体观察石杉碱甲是否具有局部抗炎作用。

材料与方法

1．实验动物:清洁级 SD雄性大鼠30只，体重为220～250g，购自上海复旦大学实验动物科学部，合格证编号:［SCXK(沪)2009－0019］2009001918815，无噪声暴露和药物使用史，耳廓反射灵敏，电子耳镜检查外耳道、鼓膜均无异常。

2．实验试剂:D－半乳糖(D－gal)购于美国Sigma公司;石杉碱甲(Hup A)购于上海复旦复华药业有限公司(批号:090504);小鼠抗人S－100单克隆抗体、NF－кBp65购于Santa ckuz Biotechnology Inc公司。

3．模型制备及分组:所选的SD大鼠在清洁安静的环境下适应性喂养1周后随机平均分为3组，均行颈背部皮下连续注射8周。D－gal组给予5%D－半乳糖(200mg/kg);D－gal+HupA组予5%D－半乳糖(200mg/kg)和石杉碱甲(0．1mg/kg)配成与模型组同体积溶液;对照组(control组)予以同体积生理盐水。

4．组织准备:上述模型制备后将各组的SD大鼠经戊巴比妥(80mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸后用4%的多聚甲醛行心脏灌注。后迅速断头，取出耳蜗，放入4%的多聚甲醛中固定，4℃过夜;常规行10%的EDTA脱钙2周;后行梯度浸糖，先浸入15%蔗糖溶液，再浸入30%蔗糖溶液，至组织块下沉。所有组织块均在液氮中保存，在－20℃的恒冷切片机上以5μm连续冠状切片，制作冷冻切片。

5．免疫荧光染色:取各组不同SD大鼠的的冷冻切片置于室温下30min，入4%的丙酮固定10min，0．01mol/L PBS漂洗5min×3次;用3%过氧化氢孵育5min，以消除内源性过氧化物酶的活性;再用0．01mol/L PBS漂洗5min×3次;10%羊血清封闭 30min，倾去不洗，滴加 1抗(1∶100)，4℃过夜，次晨37℃复温1h，PBS漂洗5min×3 次;滴加 2抗(1∶100)，37℃孵育 60min，滴加 SABC 复合物(1∶100)，37℃孵育30min，PBS 漂洗5min×3次，加DAB显色5min，终止反应，双蒸水充分洗涤，常规脱水、透明、封片。

6．定量RT－PCR分析:总RNA的提取及反转录为cDNA所需试剂由美国Invitrogen公司提供。使用SYBR Premix RT－PCR试剂盒，根据制造商的说明进行PT－PCR操作。引物序列列表见表1。

表1 定量RT－PCR所用的引物列表

7．统计学方法:采用SPSS 17．0进行统计分析，数据统计描述采用均值±标准差(±s)，采用t检验对计量资料进行组间比较，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．石杉碱甲阻止施万细胞的激活、阻止NF－κB的活化:S－100标记的施万细胞及NF－κB的免疫荧光染色如下图1所示，由图可知。3组大鼠耳蜗组织中S－100标记的施万细胞和NF－κB增亮影基本重叠，说明在胶质细胞中NF－κB参与细胞的激活。与对照组(control组)比，D－gal组耳蜗组织中的施万细胞和NF－κB均高度显色，说明此时施万细胞被激活，同时NF－κB被活化，即D－半乳糖诱导形成的老年性聋耳蜗内的神经胶质细胞激活。而D－gal+HupA组耳蜗组织中的施万细胞和NF－κB均正常显色，说明D－半乳糖诱导的老年性聋经石杉碱甲作用后耳蜗组织的施万细胞的激活被抑制。即表明石杉碱甲具有阻止施万细胞激活和NF－κB的活化的作用。

2．石杉碱甲抑制D－半乳糖诱导老年性聋的局部炎症反应:耳蜗组织中测定的IL－1β、IL－6、TNF－α的含量如下图2所示。与对照组相比，D－gal组内的IL－1β、IL－6、TNF－α明显升高，差异具有统计学意义(P＜0．05)。而与D－gal+HupA组相比，D－gal组内的IL－1β、IL－6、TNF－α也明显升高，差异具有统计学意义(P＜0．05)。

图1 耳蜗组织中施万细胞、NF－κB p65免疫荧光

讨 论

老年性聋是人体老化过程在听觉器官中的表现，其发病机制较为复杂，至今还没有统一的发病机制理论［4］。其中线粒体老化计时假说最引人瞩目，该理论认为:线粒体氧利用率高，是活性氧的主要亚细胞来源，当活性氧的产生和清除之间失去平衡，就会出现氧化应激［5］。活性氧对生物大分子具有很强的破坏作用，可导致线粒体DNA、细胞等广泛的损伤，内源性抗氧化酶减少，线粒体膜稳定性破坏，向细胞释放细胞色素C，通过级联反应激活最终导致细胞凋亡。因此，设法减少机体氧自由基的产生、改善抗氧化防御和氧化损伤的修复功能，将大大提高老年性聋的防治水平。

图2 耳蜗组织中炎症因子的RT－PCR

石杉碱甲(HupA)是从草药蛇足石杉中分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体。因其具有易透过血脑屏障、口服生物利用度好、且持续作用时间更长和外周不良反应少等优点，目前已在临床上用于阿尔茨海默病(AD)、重症肌无力、精神分裂症以及其他神经退行性疾病。目前国内外已有文献报道石杉碱甲有抗炎、抗衰老的作用。故本实验组就利用石杉碱甲的此优点研究其对老年性聋的局部抗炎作用［6，7］。

在前期的实验中，笔者已经通过检测ABR对各组大鼠的各波潜伏期的变化进行了观察，D－gal+HupA组ABR阈值出现Ⅲ波潜伏期、Ⅰ～Ⅴ波间期缩短，听觉通路上神经传导加快，表明石杉碱甲可以提高中枢对声音的加工过程，进而推断这可能与改变轴突脱髓鞘变有关［8］。在本实验中为了进一步探究此推断。

施万细胞是一种周围神经胶质细胞，为轴突提供支持并形成髓鞘，其功能极其活跃，可分泌多种活性物质，这些物质对维持神经纤维的存活、生长及再生具有重要的意义。而NF－κB是近年来发现的转录因子家族的新成员，是细胞内最重要的核转录因子，在许多细胞刺激介导的细胞信息转录调控中起核心作用，参与多种基因的表达和调控，是细胞激活的标志。NF－κB一般存在于静息细胞中，在多种因素激活下进入细胞核，与DNA模板上的特意蛋白结合，诱导转录、产生和释放各种细胞因子。故本实验将石杉碱甲的局部抗炎作用放眼于施万细胞和NF－κB是否激活受抑制，进而说明石杉碱甲是否具有对局部神经的抗炎、抗氧化作用。

D－gal组的实验结果即可显示施万细胞的激活和NF－κB的活化是一致的，而D－gal+HupA组则明显受抑制。即表明:石杉碱甲具有抑制施万细胞的激活和NF－κB的活化。在此基础上，本实验继续探究了NF－κB依赖的炎性因子(如 IL－1β、IL－6、TNF－α)的表达，实验结果的一致性进一步说明石杉碱甲的局部抗炎作用。我们即可得石杉碱甲阻止了施万细胞、抑制NF－κB的活化，继而下调NF－κB依赖的炎性因子(如 IL－1β、IL－6、TNF－α)的表达。

因此，石杉碱甲对耳蜗组织的局部抗炎作用将有益于老年性聋的临床治疗，然而这一结论还有待于进一步的临床研究证实。

1 Seidman MD，Ahmad N，Bai U．Molecular mechanisms of age－related hearing loss［J］．Ageing Res Rev，2002，1(3):331 －343

2 Xiao XQ，Yang JW，Tang XC．Huperzine A protects rat pheochromocytoma cells against hydrogen peroxide－induced injury［J］．Neurosci Lett，1999，275(2):73 －76

3 Xiao XQ，Yang JW，Tang XC．Huperzine A and tacrine attenuate β －anyloid peptide induced oxidative injury［J］．Neurosci Res，2000，61(5):564－569

4 Mitchell P，Gopinath B，Wang JJ，et al．Five － year incidence and progression of hearing impairment in an older population［J］．Ear Hear，2011，32(2):251 －257

5 Moon H，Baek D，Lee B，et al．Soybean ascorbate peroxidase suppresses Bax－induced apoptosis in yeast by inhibiting oxygen radical generation［J］．Biochem Biophys Res Commum，2002，290(1):457－462 6 Ruan Q，Liu F，Gao Z，et al．The anti－inflamm－aging and hepatoprotective effects of huperzine A in D －galactose－treated rats［J］．Mech Aging Dev，2013，134(3 －4):89 －97

7 Wang ZF，Wang J，Zhang HY，et al．Huperzine A exhibits anti－ inflammatory and neuroprotective effects in a rat model of transient focal cerebral is chemia［J］．J Neurochem，2008，106(4):1594 －1603

8 孔德秋，顾健，李聪等．石杉碱甲对D－半乳糖诱导老年性聋大鼠听觉功能的影响评估［J］．中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2013，93(19):199－203