EB病毒在不同类型淋巴瘤中的表达及检测方法的比较

卢 璐 孙文文 袁风菊 杨开颜

EB病毒是一种嗜人类淋巴细胞的DNA病毒，属于人类疱疹病毒4型(γ－herpesvirus)在全世界的感染率大于90%，大多数人终身EBV潜伏感染而无任何症状，少数情况下如机体免疫功能明显下降时，免疫系统与病毒之间的平衡被打破，则可引起严重的相关性疾病，特别是良性或恶性的淋巴增殖性疾病。国内外已有大量的文献报道，EBV阳性检出率在不同地区，不同类型的淋巴瘤之间存在差异［1，2］。本实验应用免疫组织化学、原位杂交及PCR方法对恶性淋巴瘤中EBV感染进行检测，旨在探讨不同类型的淋巴瘤中BEV的感染情况和3种检测方法的差异性。

材料与方法

1．标本:所有标本均为2009年1月～2011年12月温州医科大学附属第一医院确诊为淋巴瘤的石蜡包埋组织57例，其中男性34例，女性23例，发病年龄25～90岁，中位发病年龄56．5岁。所有标本的切片均经2位以上病理专家重新阅读，并按照WHO 2008年淋巴瘤新分类诊断标准进行组织形态学分型。结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型12例，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T－cell lymphoma，AITCL)13例，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)12例，弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)20例。

2．主要试剂:EBV LMP－1单克隆抗体工作液、免疫组织化学两步法染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Rembrant原位杂交试剂盒为PanPath公司产品，EBER 1管核苷酸探针为地高辛标记，EBV及β－actin引物合成并订购于上海生工生物工程有限公司。

3．免疫组化检测EBV Lmp－1:采用免疫组织化学两步法，具体操作按照试剂盒说明书进行。蜡块按常规切片厚4μm，脱蜡，抗原高压修复后用一抗4℃冰箱孵育过夜，再用二抗37℃孵育30min，DAB显色，并用苏木素复染。PBS液代替一抗作为阴性对照。Lmp－1阳性定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。结果按阳性细胞所占比例分别记录，无明显阳性细胞为阴性(－)，阳性细胞数1% ～25%为弱阳性(+)，阳性细胞数26% ～50%为中等阳性(++)，阳性细胞数51% ～75%为强阳性(+++)，阳性细胞数≥75%为极强阳性(++++)。

4．原位杂交检测EBER1 mRNA表达:原位杂交具体步骤简述如下:①石蜡切片脱蜡，无水乙醇5min，自然干燥;②胃蛋白酶 37℃湿盒消化 30min，梯度乙醇脱水(70%、95%、100%)，自然干燥;③杂交，滴加探针并加盖玻片，放置湿盒中55℃恒温箱孵育60min，37℃湿盒孵育过夜。结果判定标准同免疫组化。

5．PCR方法检测EBV DNA的表达:首先是模板DNA的提取，切10μm厚石蜡切片5～10张，脱蜡清洗干燥后，用蛋白酶消化过夜，然后进行PCR扩增:β－actin引物上游为5'－CCACACTGTGCCCATCTACG －3'，下游为 5'－AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG－3'，目的片段长度为99bp。EBV引物上游为5'－CCAGACAGCAGCCAATTGTC－3'，下游为5'－GGTAGAAGACCCCCTCTTAC －3'，目的片段长度为 123bp。PCR反应体系为在0．2ml去酶EP管中依次加入2×PCR MIX 10μl、上游引物 1μl(10pmol/μl)、下游引物 1μl(10pmol/μl)、DNA 1μl、ddH2O 7μl。总反应体积为 20μl。PCR 反应体系参数:根据预试验及参考文献，确定退火温度(Tm值)及循环数:94℃预变性3min;94℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 45s，循环40次;72℃终末延伸10min。最后是琼脂糖凝胶电泳，取10μl PCR扩增产物点样在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭(1μg/μl)染色，用条带凝胶图像分析系统观察、照相。

6．统计学方法:采用SPSS 16．0统计软件进行数据分析，对不同类型淋巴瘤EBV表达差异、不同检测方式的比较及两两之间比较均采用χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．免疫组化检测结果:57例淋巴瘤中总阳性表达率为 17.5%(10/57)，13例 AITCL中 4例(30.8%)表达阳性，其中2例为“+”2例为“++”，12例NK/TCL中1例(8．3%)表达阳性为“++”，12例HL中4例(33．3%)表达阳性，3例为“++”，1例为“+”，20例 DLBC 中1例(5．0%)阳性为“++”。4种类型淋巴瘤的EBV LMP－1的表达情况见图1。

图1 EBV LMP－1在不同类型淋巴瘤中阳性表达(IHC，×400)

2．原位杂交结果:本实验57例淋巴瘤总阳性表达率为 47．4%(27/57)，12例 NK/TCL中有 10例(83．3%)表达阳性，其中1例为“++++”，6例为“+++”，3例为“++”。13例 AITCL中有6例(46.2%)表达阳性，6例均为“+”。12例HL中有5例(41．7%)表达阳性，5例均为“+”。20例DLBCL中，5例表达阳性(25．0%)，4例为“+”，1例为“++++”，此1例为器官移植后弥漫大B细胞淋巴瘤。4种类型淋巴瘤的EBER1表达情况见图2。

图2 EBER1 mRNA在不同类型淋巴瘤中阳性表达(ISH，×400)

3．PCR检测结果:57例淋巴瘤中EBV总阳性表达率为 50．9%(29/57)，12例 NK/TCL中 11例(91.7%)表达阳性，13例AITCL中8例(61．5%)表达阳性，12例HL中6例(50．0%)表达阳性，20例DLBCL中5例表达阳性(25．0%)，表达强弱有所不同。PCR检测EBV感染淋巴瘤的表达情况见图3。

图3 EBV DNA在不同淋巴瘤中的表达

4．不同类型淋巴瘤与EBV感染的关系及3种检测方法的比较:EBV在T细胞淋巴瘤中的表达高于B细胞淋巴瘤与霍奇金淋巴瘤(P＜0．05)，NK/TCL中的表达高于霍奇金淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(P＜0．05)，AITCL中高于弥漫大B细胞淋巴瘤，而结外NK/TCL与AITCL、AITCL与 HL、HL与 DLBCL之间表达差异均没有统计学意义(P＞0．05)。在3种EBV检测方法中，PCR及ISH优于IHC(P＜0．05)，而PCR与ISH之间差异没有统计学意义(P＞0.05)。

讨 论

Epstein－Barr病毒(EBV)是 Epstein和 Barr于1964年在Burkitt淋巴瘤标本的体外传代细胞中发现，具有嗜淋巴细胞和上皮细胞的特性。在细胞外成熟的病毒颗粒为球形，直径为150～180nm，EBV病毒基因是线性双链DNA，基因组长平均为172kb。EBV以潜伏感染最为常见，人群普遍易感。EBV可长期潜伏在被感染的B细胞内，形成持续的潜伏感染。其中仅极少数可发展为EBV相关的上皮细胞恶性肿瘤和淋巴瘤。本课题通过应用3种方法检测不同类型淋巴瘤中EBV感染情况来探讨EBV与不同类型淋巴瘤的感染情况及3种检测方法结果的差异性。

大量研究证明EBV与霍奇金淋巴瘤及部分T、B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤均有一定的关系。EBV感染与HL的关系较为密切，但各国所报道的HL中EBV的检出率有很大的差异，日本为65%，墨西哥为67%。秘鲁为94%，肯尼亚为92%。意大利为4l%，美国为50%左右［3］。本实验HL中EBV DNA的阳性表达率为50．0%，在我国报道的48% ～57%范围内［4］。很多年来一直认为EBV感染仅与B细胞淋巴瘤的发病有关，但越来越多的研究表明，在非霍奇金淋巴瘤中，EBV阳性的T细胞淋巴瘤远较EBV阳性的B细胞淋巴瘤多，尤其是NK/TCL和AITCL［5］。其中AITCL中EBV检出率为75%，有学者报道EBV在鼻型NK/T细胞淋巴瘤中DNA检出率为69．66%，但EBV在B细胞淋巴瘤中的检出率仅为5%～8%左右［6～8］。本研究对4种淋巴瘤做了初步研究和阐述，通过PCR数据分析显示EBV在NK/TCL和AITCL中表达偏高，而在HL和DLBCL中表达偏低，而AITCL与HL阳性率虽有差异，但没有统计学意义，结果表明EB病毒感染在不同类型的淋巴瘤中的存在着一定的差异性，对临床是否把抗EBV治疗作为治疗某种类型淋巴瘤的必要手段有一定的参考价值。笔者将收集更多的标本对不同类型淋巴瘤与EBV的关系作进一步的研究。

研究表明，EBV阳性的NK/TCL淋巴瘤患者生存率明显低于阴性患者，故对EBV感染的检测至关重要［9，10］。EBV 的检测方式主要有免疫组化、原位杂交及聚合酶链反应，而3种检测方法原理不同，故检测结果存在一定的差异性。免疫组化检测方法中LMP－1为胞质及胞膜着色，只能说明被感染细胞中EBV的蛋白表达情况，检测不出病毒的定位和转录数量。但该方法具有操作简单、方便、价格便宜等优点。原位杂交检测EBER被认为检测肿瘤细胞中EBV的金标准，其敏感度高，特异性强，EBER1染色为胞核着色，结果清晰，容易辨认，反映的是DNA转录情况，但实验周期较长(36～40h)，过程较为繁琐［11］。PCR从DNA水平检测，其敏感度比免疫组化和原位杂交高，对样本要求低，但PCR检测成本高且其特异性略差，结果易受各种不确定因素影响，易出现假阳性或假阴性，有时需要多次重复才能得出可靠结果。3种方法各有优缺点，PCR与原位杂交方法敏感度比免疫组化高，这与国外研究结论一致，但免疫组化操作方便，因此临床工作中可把免疫组化作为EBV的初筛方法［12］。本实验 IHC、ISH、PCR 3种方法阳性表达率分别为 17．5%、47．4%、50．9%，数据分析显示PCR和ISH比IHC更为敏感，而PCR与原位杂交之间没有统计学差异。EBV阳性是淋巴瘤的独立不良预后因素，故EBV的检测对于淋巴瘤的诊断、治疗、及预后具有重要的指导意义。检测方法不同可能是导致各报道中恶性淋巴瘤EBV检出率相差悬殊的原因之一。故建议在临床病理诊断工作中尽量将3种方法结合，相互补充，以提高其检出率。

EBV在全世界感染率非常高，尤其是在欠发达的国家，EBV活动性感染以及EBV感染相关的淋巴瘤发病率更高，因此加强EBV感染的检测和EBV阳性淋巴瘤的治疗是十分重要的。尽管关于EBV与淋巴瘤之间关系的研究已经取得突破性进展，如抗EBV疫苗，但仍然存在很多问题。EBV感染所致淋巴瘤的内在机制尚不明确，仍有待进一步研究。

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