OATP1B1及CYP3A4基因多态性对阿托伐他汀转运代谢影响的分子机制

袁钊，李新华，黄世博，夏春华，熊玉卿 （.南昌大学医学院临床药理研究所，江西 南昌330006；.南昌大学校医院，江西 南昌330006）

阿托伐他汀（atorastain，ATV）是新一代β－羟基－β－甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶抑制剂，可竞争性抑制胆固醇的生物合成，显著降低血脂水平［1］。虽然ATV 已广泛用于高胆固醇血症的治疗，但其调脂疗效呈现明显的个体差异［2］。有研究表明，ATV 与其他他汀类不同之处在于，其既是摄入型转运体有机阴离子转运多肽B1（OATP1B1）的底物，又 主 要 经CYP3A4 代 谢［3－4］。故OATP1B1及CYP3A4的基因多态很可能影响ATV 的转运与代谢，从而导致ATV 疗效和不良反应个体差异的出 现［5－6］。系 统 研 究 ATV 转 运、代 谢 相 关 的OATP1B1及CYP3A4基因多态性及其相互间的关联意义重大。为此，本研究从体外分子水平，系统考察ATV 在不同基因型OATP1B1及CYP3A4个体中转运代谢过程的差异，分析 OATP1B1 及CYP3A4基因多态性对ATV 转运代谢影响的分子机制。为进一步的体内研究及正确确立ATV 的临床合理用药提供前期研究数据及理论依据。

1 材料

1.1 仪器 2010EV 液质联用仪、2010A 高效液相色谱仪为日本Shimadzu公司；550型酶标仪（美国Bio－RAD 公 司）；XP205 型 电 子 分 析 天 平（美 国Mettler Toledo公 司）；ZHWY－2102C 双 层 恒 温 培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）。

1.2 药品与试剂 阿托伐他汀对照品（中国食品药品检定研究院，批号201102101，含量＞97.0%）；瑞舒伐他汀内标（中国食品药品检定研究院，批号201001002，含量＞99.7%）；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均为美国Amresco公司产品；高糖DMEM 培养基、非必需氨基酸（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；PBS缓冲液（南昌长城生物科技有限公司）；6－磷酸－葡萄糖（6－P－G）、6－磷酸－葡萄糖脱氢酶（6－P－G）、氧化型辅酶Ⅱ（β－NADP）均为Sigma公司产品；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.3 其他材料 OATP1B1质粒模型：成功转染慢病毒包装后OATP1B1＊1a、＊5、＊15 质粒的HEK293T 细胞。体外转运试验中cDNA 转染的HEK293T 细胞（自身不表达OATP1B1，通过转染实现高表达）可作为一种有效的工具，用于预测OATP1B1 SNPs对药物体内处置过程的影响［7］；人重组CYP3A4酶：购自陕西北美基因有限公司，其酶蛋白含量及酶活性均已标定。

2 方法

2.1 ATV 在不同基因型OATP1B1质粒中转运差异的研究

2.1.1 溶液配制 （1）ATV 对照品贮备液：精确称取ATV 对照品22.02 mg，以3.035 mL DMSO 配制成6 000μmol·L－1的贮备液，－20 ℃保存，临用前进行稀释；（2）瑞舒伐他汀标准品贮备液：精确称取瑞舒伐他汀标准品17.41 mg，以10 mL DMSO 配制成1 739μmol·L－1的贮备液，－20 ℃保存，临用前进行稀释。

2.1.2 ATV 对HEK293T 细胞毒性试验 取对数生长期HEK293T 细胞，通过细胞计数器调整细胞密度至1.0×106／mL，每孔加200μL 细胞悬液接种于96孔培养板，培养24 h后换液，实验组分别加入含ATV 系列浓度的培养液，对照组和空白组只加培养液，边缘空用PBS填充，每组设6个复孔，24 h后每孔加入5 mg·mL－1的MTT20μL，培养4 h后吸弃孔内培养液，每孔加150μL DMSO 溶液，置于双层空气恒温振荡器中，37 ℃、50 r·min－1振荡10 min，使甲瓒充分溶解，用酶联免疫检测仪于波长490 nm 处测定其吸光度值，空白孔调零，记录各孔吸光度值。计算细胞存活率：细胞存活率＝（实验组吸光度值／对照组吸光度值）×100%。

2.1.3 HEK293T 细胞样品处理方法的建立 采用冰醋酸－醋酸乙酯液液萃取法提取细胞中的待测样品。取100μL 完成摄取试验的HEK293T 细胞破碎液，加入20μL 内标瑞舒伐他汀（10μmol·L－1），加入30μL 冰醋酸，振荡30 s，加入1 mL 醋酸乙酯，涡旋振荡2 min，于20 000 r·min－1离心10 min，取0.8 mL 上清液于浓缩仪中挥干（60 ℃30 min），加入100μL 甲醇复溶，20 000 r·min－1离心10 min后，取10μL进样分析。

2.1.4 ATV LC－MS分析方法建立

（1）色谱条件 流动相：乙腈－水（含0.1%甲酸）＝60∶40；流速：0.2 mL·min－1；色谱柱：Shimadzu Pack VP－ODS C18（5μm，150 mm×2.0mm）。

（2）质谱条件 离子化方式：电喷雾离子化；采集方式：选择性离子监测；加热块温度：200 ℃；CDL电压：25 V；检测电压：－1.65 kV；检测方式：正离子检 测，检 测 离 子［M－H］－：阿 托 伐 他 汀m／z 559.40；内标（瑞舒伐他汀）m／z 482.30；雾化气流速：1.5 L·min－1；干燥气流速：2.0L·min－1。

2.1.5 考马斯亮蓝法［8］测定HEK293T 细胞裂解液蛋白含量 分别加入1.0 mg·min－1的蛋白质标准溶液0，1，2，3，4，5μL，其余用纯化水补充，使样品总体积为5μL，加入考马斯亮蓝G－250溶液195 μL，把酶标板放在振荡器上振荡30 s，充分混匀，放置2 min后再次振荡，然后在595 nm 下比色测定（1 h内完成）以标准曲线0号管做参比，在595 nm 波长下比色，记录吸光值，以蛋白质含量（μg·mL－1）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线，用于计算蛋白浓度值。

2.1.6 ATV 在 表 达 不 同 基 因 型OATP1B1 的HEK293T 细胞中的摄取试验 取对数生长期HEK293T 细 胞（HEK293T、OATP1B1 ＊ 1a－HEK293T、OATP1B1＊5－HEK293T、OATP1B1＊15－HEK293T 细胞），将细胞悬液稀释为1.0×106／mL，每孔0.5 mL，加于12 孔培养板内，培养2 d。实验前，吸弃旧培养液，加入37 ℃预热的摄取缓冲液荡洗细胞3次，最后一次置于37 ℃培养箱温孵30 min后，吸弃缓冲液，用于药物摄取试验。

（1）pH 值对不同基因型OATP1B1－HEK293T摄取的影响 于上述准备用于细胞摄取试验的12孔板中分别加入pH 值分别为6.5，7.5，8 的含10 μmol·L－1ATV 摄取缓冲液0.5 mL，每组设5个复孔，同时设置不加药的空白孔。置37 ℃培养箱中孵育20 min，吸弃细胞上层培养液，加入37 ℃摄取缓冲液洗涤4次后加入0.2 mL 无菌水于－80 ℃超低温冰箱反复冻融3 次。细胞破碎液移入EP 管于20 000 r·min－1离心10 min。取细胞破碎液100μL按“2.1.3”项 操 作 后 进 样 分 析，LC－MS 法 测 定HEK293T 中ATV 的含量，另取50μL细胞破碎液用于考马斯亮蓝法细胞蛋白含量测定，摄取量以pmol·min－1·mg－1protein表示。

（2）时间对不同基因型OATP1B1－HEK293T摄取的影 响 每孔加入0.5 mL 20μmol·L－1的ATV 摄取缓冲液。加完药后，置37 ℃的培养箱中分别孵育5，10，20，40，60 min，每组设5个复孔，同时设不加药物的空白孔，按时间点吸弃培养液，其余操作同前。

（3）ATV 浓 度 对 不 同 基 因 型 OATP1B1－HEK293T 摄取的影响 每孔加入150，100，50，20，10，5μmol·L－1ATV 摄取缓冲液0.5 mL，每浓度设5个复孔，同时各设5个不加药的空白孔。置37 ℃的培养箱中分别孵育一定时间，吸弃上层培养液，其余操作同前。

2.2 ATV 在不同基因型CYP3A4重组酶系中代谢差异的研究

2.2.1 ATV 代谢孵育方法建立 孵育总体系200 μL，含 氯 化 镁3.3 mmol·L－1、6－磷 酸－葡 萄 糖3.3 mmol·L－1、6－磷 酸－葡 萄 糖 脱 氢 酶20μg·mL－1、NADP＋1.3 mmol·L－1、系列浓度ATV10μL、重组酶1 mg·mL－1，其他体积由PBS 缓冲液（pH 7.4）补充。37 ℃、120 r·min－1预温孵5 min后，加入40μL NADPH 反应体系孵育，孵育完成后，加入100μL冰乙腈终止反应，涡旋3 min，4 ℃、20 000 r·min－1离心10 min，取上清用于HPLC分析。

2.2.2 ATV 及其代谢产物HPLC 分析方法建立 色谱 条 件：色 谱 柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈－20 mmol·L－1醋酸胺＝38∶62；进样量：20μL；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：246 nm；柱温：室温；分析时间：14 min。

由于未能获得ATV 代谢产物邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀的对照品，本实验以ATV作为标准，利用代谢产物峰面积与剩余底物峰面积的比值，对代谢产物进行相对定量。

2.2.3 重组酶代谢ATV 动力学参数测定条件的选择

（1）ATV 在重组酶中代谢的时间曲线 按“2.2.1”项下方法进行孵育，固定孵育体系中重组酶蛋白含量为1.0 mg·mL－1。孵育时间点设计为0，10，20，40，60，90 min。零时间点采用不加启动剂孵育90 min后，先加入200μL冰乙腈，然后再加启动剂。结果直接将代谢产物峰对孵育时间作图，寻找在线性范围内的时间点。

（2）ATV 在重组酶中代谢的酶浓度曲线 按“2.2.1”项下方法进行孵育，其中酶的浓度通过体系中总蛋白含量来控制。分别使孵育体系中总蛋白含量为0.5，1.0，1.5，2.0mg·mL－1，孵育60 min后，加入200μL冰乙腈终止反应，处理后进样分析。结果直接将代谢产物峰对酶浓度作图，寻找在线性范围内的酶浓度点。

2.2.4 人CYP3A4重组酶对ATV 代谢的酶动力学参数测定 按“2.2.1”项下方法配置孵育体系，使ATV 浓度为10～150μmol·L－1。孵育体系中甲醇体积分数低于0.5%。孵育60 min，蛋白质含量为1.0mg·mL－1。酶动力学参数Km和Vmax由产物生成法测定，即以底物生成的速率作为代谢速率。

3 结果

3.1 ATV 对HEK293T 细胞的毒性反应 结果表明，ATV 在1～200μmol·L－1范围内对HEK293T细胞毒性小，细胞活力大于80%，超过上述药物浓度范围时出现细胞毒性，细胞形态发生变化。

图1 ATV 对HEK293T 细胞的抑制率（n＝4±s）Fig 1 The living rate of ATV determined by MTT（n＝4±s）

3.2 HEK293T 细胞裂解液蛋白曲线 考马斯亮蓝法建立测定蛋白标准曲线，结果蛋白量在1～30 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y＝0.017 5 X＋0.030 5，R2＝0.990 1（n＝5）。用此线性方程计算HEK293T 细胞的裂解液稀释后的蛋白含量。

3.3 ATV 在表达不同基因型 OATP1B1 的HEK293T 细胞中的摄取参数

3.3.1 pH 值对摄取转运的影响 结果表明，pH 值为6.5，7.5，8 的 摄 取 缓 冲 液 对OATP1B1＊1a－HEK293T、OATP1B1＊5－HEK293T 与OATP1B1＊15－HEK293T细胞摄取ATV 的差异无统计学意义。3.3.2 时间对摄取转运的影响 考察分别表达OATP1B1＊1a、OATP1B1＊5、OATP1B1＊15 的HEK293T 细 胞 在5，10，20，40，60 min 时 对20 μmol·L－1ATV 的摄取情况。结果表明，随着时间的延长，对ATV 的摄取增加，在20 min时摄取均趋于饱和，因此，在下一步的实验中将摄取终止时间设置为20 min。

3.3.3 ATV 浓度对摄取转运的影响 表达OATP1B1＊1a、＊5、＊15 基因的HEK293T 细胞在20 min内对系列浓度的ATV 摄取情况见图2。由图2可见，随着ATV 浓度增加，3组摄取量趋于增加并逐渐饱和，呈现酶动力学特征曲线。

图2 药物浓度对ATV 在转染目的基因的HEK293T 细胞中摄取情况的影响Fig 2 Effect of durg concentration on the uptake of ATV in HEK293T cells transfected with target gene

由表1 可以看出，表达OATP1B1＊1a 或与OATP1B1＊5的细胞对ATV 的转运摄取有较大的差异，OATP1B1＊5 对ATV 的转运能力降低；与OATP1B1＊15相比，OATP1B1＊5转运活性较低，OATP1B1＊1a与OATP1B1＊5对系列浓度ATV的转运差异有统计学差异（P＜0.05）。见表1。

3.4 ATV 在CYP3A4重组酶系中的代谢确证 用含有野生型CYP3A4 重组酶（＊1）或突变型CYP3A4重组酶（＊3、＊5、＊16、＊18）的孵育体系对ATV 进行代谢，孵育后反应液经HPLC分析，可以观察到分别在3.5，9.4 min处有代谢峰，两个代谢物峰均能稳定出现，且代谢物峰面积随ATV 底物含量改变成比率增加，在含无活性重组酶的孵育体系中孵育后，在相同位置则没有ATV 代谢峰出现。见图3。

表1 ATV 在表达不同基因型OATP1B1－HEK293T 细胞中的吸收动力学参数Tab 1 Kinetic parameters of uptake of ATV in different genotypes OATP1B1 expression of HEK293T cells

图3 HPLC分析ATV 的特异性A.ATV 孵 育 样 品（无NADPH）；B：ATV 孵 化 样 本，峰1：ATV；peak2，peak3：ATV 代谢物Fig 3 HPLC analysis of the specificity of ATVA.ATV incubation sample－no NADPH；B.ATV incubation sample，peak1：ATV；peak2，peak3：ATV metabolite by CYP3A4 wild type

3.5 CYP3A4重组酶对ATV 代谢动力学实验孵育条件摸索 如图4A 所示，在0～90 min内，代谢物的生成量呈线性增长，说明在此段时间内，ATV代谢速率是恒定的。如图4B 所示，在蛋白含量0.25～2.0mg·mL－1范围内，代谢物的生成量也呈线性增长，说明在2.0mg·mL－1以下，酶没有饱和。考虑到实验需要一定的代谢量以利于定量，遂选择孵育时间60 min，酶蛋白为1.0mg·mL－1。

图4 CYP3A4＊1中孵育条件对ATV 代谢情况的影响A.代谢量与培养时间的关系；B代谢量与孵育蛋白质含量的关系Fig 4 The relationship between metabolism and incubation condition for CYP3A4＊1A.metabolic amount vs.incubation time；B metabolic amount vs.incubation protein concentration

3.6 CYP3A4重组酶对ATV 代谢的酶动力学参数及比较 将实验数据按米曼氏方程拟合，内在清除率CLint等于Vmax／Km，CLint是比较突变重组酶与野生型重组酶代谢差异的标准，CLint值越大表明该酶对底物的代谢活性越大，比较CYP3A4重组酶对ATV 代谢的酶动力学参数（表2）。

表2 ATV 在人重组酶CYP3A4＊1／＊3／＊5／＊16／＊18中按米曼氏方程拟合的代谢动力学参数Tab 2 ATV metabolic kinetic parameters of Michaelis－Menten equation fitting in human Recombinase CYP3A4＊1／＊3／＊5／＊16／＊18

研究结果表明，CYP3A4＊3的Km与野生型的相近，代谢速率略高于野生型，CLint值比较看来酶活性略大于野生型。CYP3A4＊5 的Km虽略高于野生型，但显著高于野生型的代谢速率，弥补了其对ATV 的低亲和力，CLint值比较看来酶活性显著大于野生型。CYP3A4＊16 的Km显著高于野生型，代谢速率与野生型的相近，CLint值比较看来酶活性显著低于野生型。CYP3A4＊18的Km与代谢速率均略高于野生型，CLint值比较看来酶代谢ATV 的活性与野生型相近。

4 讨论

本文通过分子学水平探明OATP1B1多态性对ATV 转运影响的机制及CYP3A4 多态性对ATV代谢影响的机制。

自Ieiri等［9］研究发现口服同等剂量ATV 的高血脂患者中，携带c.521CC等位基因的患者相比c.521TT AUC增高144%的报道以来，Yoshio Kameyama等［10］利用感染表达OATP1B1的HEK293T细胞，证实ATV 为OATP1B1 的底物。诸多围绕摄入型转运体OATP1B1对药物转运影响的研究进一步证明，体外转运试验中cDNA 转染的HEK293T 细胞可作为一种有效的工具，用于预测OATP1B1 SNPs对药物体内处置过程的影响［7］。本研究室亦通过构建OATP1B1重组质粒模型，证实ATV 在不同基因型HEK293T 细胞的摄取率OATP1B1＊5明显小于OATP1B1＊1a。本次研究表明OATP1B1 521 位点（亚洲人群的突变率为16%［11］）可能是ATV 转运的分子作用点，也是影响OATP1B1对ATV 转运能力的关键位点，该位点发生突变会导致转运入肝至靶点的ATV 量减少，难以达到相应的降脂疗效，故临床上应关注患者OATP1B1 521位点的突变情况，指导ATV 临床合理用药。

CYP3A4是参与他汀类药物Ⅰ相代谢过程中最主要的酶类［12］，国内外研究显示CYP3A4酶活性具有明显的个体差异（可达60倍），会导致治疗失败或难以预料的毒副作用的发生［13］。而90% 的CYP3A4代谢活性个体差异均由基因多态引起。CYP3A4多态性会导致患者间出现显著的个体差异，影响他汀类药物治疗降脂疗效，甚至出现横纹肌溶解等不良反应［14］。迄今为止，在中国人体中已发现的CYP3A4编码区突变基因型主要为CYP3A4＊3、＊5、＊16 和＊18，其发生率虽然不高，其中CYP3A4＊3最早在32名中国人中发现1例突变，而CYP3A4＊5、＊16 和＊18 突变发生率均在1%左右［15］。而有关这些位点突变后酶活性的变化文献报道并不一致，酶活性可能会因底物不同而存在差异［16］。不同基因型CYP3A4 酶对ATV 代谢过程影响有何差异尚未见展开研究。我们这次研究表明CYP3A4 酶这些位点的突变会不同程度影响CYP3A4对ATV 的代谢活性，故ATV 在临床用药时也应关注患者CYP3A4不同位点的突变情况。

总之，药物转运体 OATP1B1 及代谢酶CYP3A4基因多态性会对ATV 的转运代谢过程产生影响，从而导致巨大个体差异，这些差异将会引起毒副作用或无效治疗的发生。临床用药过程中，应密切关注个体差异与基因多态的关联，并针对不同患者通过减少剂量避免不良事件的发生，或更换药物避免无效治疗，以免延误最佳治疗期。

目前，大部分有关基因多态性对他汀类药物影响的研究，都只考虑某一种多态性对他汀类药物的影响，而他汀类药物在体内的代谢、转运、产生药效的过程十分复杂，影响因素众多，单个遗传决定因素难以全面反应多态性所致影响，同时考虑多个基因联合 效 应 更 具 现 实 意 义。如OATP、P－gp［17］、CYPs、LDL－受 体［18］、CETP［19］、ApoE［20］及HMGCoA 还原酶［21］等多态性均不同程度影响他汀类药物代谢、转运及药效的改变。因此，研究在基因多态“网络”对他汀类药物转运、代谢及药效的影响，为临床上个体化用药提供实验数据和理论依据，确保用药的安全性和有效性，意义重大。

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