TLR9在儿童慢性鼻－鼻窦炎及正常鼻黏膜组织中的差异表达＊

夏忠芳， 王智楠△， 乐建新， 徐忠强， 崔 珑

1武汉市妇女儿童医疗保健中心耳鼻咽喉科，武汉 430016

2华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科，武汉 430022

近年来研究表明先天免疫系统中Toll样受体（toll－like receptors，TLRs）在抗原识别和先天免疫中发挥重要作用，机体多种细胞能表达TLRs，尤其是参与机体第一道防线的细胞［1］；其家族中TLR9因子能识别外源性微生物CPG 基序及内源性有害物质的刺激［2］。作为呼吸道的第一道防线，鼻窦腔如何运用机体的免疫过程来抵御吸入空气中的病原体，慢性鼻－鼻窦炎中鼻窦黏膜中是否存在先天的免疫应答异常，目前尚未见广泛研究。本研究通过免疫组化及免疫荧光共聚焦方法，观察6～12岁慢性鼻－鼻窦炎鼻黏膜组织中TLR9因子的表达及变化，分析先天性免疫在儿童慢性鼻－鼻窦炎发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

①病变组：根据EPOS关于慢性鼻－鼻窦炎的诊断标准［3］选择病例：病史≥12 周；病变在鼻腔黏膜及至少波及1个窦腔；必须具备以下至少2项症状：鼻塞和／或鼻漏（前／后鼻孔）、面部疼痛／压迫感或嗅觉减退／消失；CT 显示鼻窦和／或窦口复合体的黏膜改变；鼻内镜下中鼻道和／或鼻窦内有脓性分泌物和／或黏膜水肿阻碍窦口复合体。选择武汉市妇女儿童医疗保健中心及武汉市协和医院耳鼻咽喉科2008年～2012年符合上述标准的慢性鼻－鼻窦炎共12例患儿。这12例患儿未合并鼻息肉；变应原皮试阴性；均行鼻窦内窥镜检查及在病情稳定期行mini－FESS术，术前不使用药物。

②正常组：随机选择12 例未罹患慢性鼻－鼻窦炎的单纯腺样体肥大的儿童，并行腺样体切除术的患儿。

1.2 取材及方法

1.2.1 取材 12例病变组患儿在全麻下行mini－FESS手术过程中，取病变的黏膜组织及下鼻甲部分黏膜进行比较。12例正常组在行腺样体切除手术过程中，在术前征得家长同意的情况下，于下鼻甲取小部分黏膜（约0.2cm×0.2cm×0.2cm）。每份标本分成2 份，1 份行生物素免疫组化，1 份行FITC免疫荧光组化。

1.2.2 免疫组化及免疫荧光共聚焦显微镜操作步骤 使用的所有试剂均为分析纯，单克隆羊抗人TLR9抗体、生物素抗羊二抗、带荧光标记FITC 抗羊二抗均采购于ICN Biomedicals公司（美国），无菌塑料制品采购于NUNC公司（丹麦）。

取下的标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，按免疫组化及免疫荧光的的技术要求操作。病变组及对照组的标本中均设阴性对照，即标本中不加入一抗（单克隆羊抗人TLR9抗体），其余步骤均一致。

将石蜡切片厚5μm，每份标本分别常规脱蜡，3%H2O2去离子水孵育10～30min，灭活内源性过氧化物酶；蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min；室温血清封闭15～30 min；滴加1∶400的羊抗人TLR9抗体一抗，4℃过夜。次日PBS（pH7.5）冲洗，3min×5次；滴加生物素标记的1∶200 抗羊二抗，37℃孵育30 min，PBS 冲洗，3 min×5 次；37℃孵育30 min，PBS冲洗，3min×5次。DAB 显色5 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。Olympus显微镜下观察并照相，TLR9阳性表达为棕褐色。

免疫荧光检测时，加一抗过夜后，第2天在暗室中加入FITC标记的1∶200抗羊二抗，DAPI染色，缓冲甘油封片。荧光显微镜下观察发现有荧光后，置入共聚焦显微镜下观察，FITC 激发波长为488 nm，采集图像，使用IPP 软件测量阳性颗粒的吸光度值，分析TLR9的表达量。TLR9阳性表达为绿色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行数据分析，正常组和病变组标本的吸光度平均值用均数±标准差（±s）表示，两者间的差异性比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组及病变组的免疫组化和免疫荧光的表达情况

在正常组的鼻黏膜中发现有TLR9 阳性颗粒的表达，从标本中看出TLR9的表达主要分布在黏膜下层及腺体周围（图1A、B），在慢性鼻－鼻窦炎的标本中也发现有TLR9阳性颗粒的表达，分布在腺体周围（图1C）。TLR9阴性表达见图1D。

共聚焦显微镜观察标本，发现正常鼻黏膜组织中TLR9的表达也位于黏膜下层（图2A）及腺体周围（图2B），慢性鼻－鼻窦炎标本中TLR9 的表达位于腺管周围（图2C）。

图1 正常组及慢性鼻－鼻窦炎鼻黏膜TLR9表达（免疫组化）Fig.1 The expression of TLR9in chronic rhinosinusitis and normal nasal mucosa tissues（immunohistochemistry）

2.2 正常组及病变组TLR9阳性颗粒吸光度值比较

使用IPP软件测量12例病变组与12例正常组标本中TLR9阳性颗粒的吸光度值，并进行比较，结果显示：慢性鼻－鼻窦炎组的吸光度平均值为（105.3±30.8），正常组为（214.9±57.5），P ＜0.05，提示TLR9在慢性鼻－鼻窦炎标本中的吸光度值是下降的，与正常鼻黏膜组织比较差异有统计学意义。

图2 正常组及慢性鼻－鼻窦炎鼻黏膜TLR9表达（免疫荧光共聚焦显微镜）Fig.2 The expression of TLR9in chronic rhinosinusitis and normal nasal mucosa tissues（immunofluorescence confocal microscopy）

3 讨论

目前认识到慢性鼻－鼻窦炎的发病与很多因素有关，但确切的发病机制现仍未完全清楚。慢性鼻－鼻窦炎的病理基础是炎性改变，主要表现为黏膜水肿，炎性细胞的浸润，导致窦口狭窄和引流通道受阻［4］。在透射电镜下，可见慢性鼻－鼻窦炎的鼻黏膜细胞表面纤毛数减少，纤毛倒伏，胞质内有空泡形成［5］。目前很多学者倾向于：慢性鼻－鼻窦炎的发生是其免疫防御功能失调所致［6］；鼻腔作为机体与外界相通的门户，存在着先天免疫防御系统，以应对各种体内外因素对机体的伤害［7］。然而先天免疫防御途径最近才开始受到关注，TLRs（toll－like－receptors）的发现使得对天然免疫防御机制的认识达到了一个新的水平［8］，其中TLR9 是TLR 家族的重要成员，TLR9在介导外源CpG DNA 激活先天免疫过程中有重要的生物学意义［9］。

在成人慢性鼻－鼻窦炎的黏膜组织及细胞中发现有TLR9的表达［10－11］，在儿童慢性鼻－鼻窦炎黏膜上皮组织中情况如何？故我们选择了12例慢性鼻－鼻窦炎患儿，12 例未罹患慢性鼻－鼻窦炎的单纯腺样体肥大的儿童作为研究对象，以期探究儿童慢性鼻－鼻窦炎黏膜上皮组织中TLR9的表达特点。

我们采用免疫组化及免疫荧光共聚焦的实验技术，检测鼻黏膜组织中TLR9 蛋白的分布及特点。结果发现正常鼻黏膜和慢性鼻－鼻窦炎的标本中确实存在着TLR9的表达，且主要集中在黏膜下组织及腺体周围，提示儿童的鼻黏膜组织中，存在着先天免疫防御反应的基础，推测可能TLR9因子参与或介导了该免疫应答反应。

儿童慢性鼻－鼻窦炎多为病毒及细菌感染后引起的炎症性反应［12］，TLR9含有未甲基化CpG 基序的微生物DNA 受体，能特异性识别外源细菌和病毒DNA 中的CpG 序列或人工合成的寡脱氧核苷酸（CpG—oligodeoxynucleotides，CpG－ODN），从而产生系列的免疫反应［13］。共聚焦显微镜下TLR9在慢性鼻－鼻窦炎中是处于低表达水平的，提示儿童慢性鼻－鼻窦炎的发病与TLR9介导的先天免疫异常存在着一定的关联，TLR9在该机制中可能扮演重要角色。

［1］ Janeway J R，Medzhitov R.Innate immune recognition［J］.Ann Rev Immunol，2002，10（20）：197－216.

［2］ Kaisho A S.Toll－like receptor function and signaling［J］.Allergy Clin Immun，2006，117（5）：979－987.

［3］ Fokkens W，Lund V，Mullol J，et al.European position paper on rhinosinusitis and nasal poplys（2007）［J］.Rhinol Suppl，2007，（20）：1－136.

［4］ Crombruggen K，Zhang N，Gevaert P，et al.Pathogenesis of chronic rhinosinusitis：inflammation［J］.Allergy Clin Immunol，2011，128（4）：728－732.

［5］ 夏忠芳，孔维佳，乐建新，等.人正常鼻黏膜及鼻窦炎息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定［J］.华中科技大学学报：医学版，2008，37（4）：542－544.

［6］ Andrew P L，Quynh A T，Robert P S.Altered expression of genes associated with innate immunity and inflammation rhinosinusitis［J］.Am J Rhinol，2006，20（2）：138－144.

［7］ Vandermeer J，Sha Q，Lane A P，et al.Innate immunity of the sinonasal cavity：Expression of messenger RNA for toll－like receptors［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2004，130（12）：1374－1380.

［8］ Cook D N，Pisetsky D S，Schwartz D A.Toll－like receptors in the pathogenesis of human disease［J］.Natur Immun，2004，5（10）：975－979.

［9］ Lane A P.The role of innate immunity in the pathogenesis of chronic rhinosinusitis［J］.Curr Allergy Asthma Rep，2009，9（3）：205－212.

［10］ Ramanathan M，Lee W K，Dubin M G，et al.Sinonasal epithelial cell expression of Toll－like receptor 9in is elevated in cystic fibrosis－associated chronic rhinosinusitis［J］.Am J Rhinol Allergy，2013，27（1）：30－33.

［11］ Lane A P，Truong－Tran Q A.Serum amyloid A and toll－like receptors are expressed locally in human sinonasal tissue［J］.Am J Rhinol，2006，20（1）：117－123.

［12］ Berger G，Kogan T，Paker M，et al.Pediatric chronic rhinosinusitis histopathology：differences and similarities with the adult form［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2011，144（1）：85－90.

［13］ Ballas Z.Modulation of NK cell activity by CpG oligodeoxynucleotides［J］.Immunol Res，2007，39（1－3）：15－21.