富半胱氨酸61表达与哮喘气道炎症间关系的探讨＊

曹 勇， 陈辉龙， 方慧娟

华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重病学科，武汉 430030

支气管哮喘（以下简称哮喘）是内科的常见病和多发病。限于对其发病机制的有限认识，目前仍有一部分患者的症状难以得到完全控制。这促使我们不断地进一步探讨其发病机制。

研究表明，哮喘是一种由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，气道上皮细胞、嗜酸性粒细胞、Th2淋巴细胞、Th17淋巴细胞及Eotaxin、多种白细胞介素（interleukin，IL）等组成了一个复杂的网络系统推动炎症的进展，但是这其中有许多具体分子调控环节尚不清楚。

富半胱氨酸61（cysteine－rich 61 protein，cyr61，亦称CCN1），是一种富含半胱氨酸的分泌型细胞外基质蛋白，属于CNN 家族成员之一。cyr61具有促进细胞粘附、趋化、增殖以及血管生成等功能，其可参与肌肉神经的损伤修复过程，微血管再生，细胞免疫应答，以及肿瘤细胞的炎症反应等多种疾病的病理生理过程［1－2］。近期文献表明给予小鼠重组cyr61可促进损伤气道上皮细胞的修复［3］。但是，cyr61在哮喘中的作用尚未见研究报道。

本实验拟通过免疫组织化学方法检测cyr61在哮喘小鼠模型肺组织中的表达，并进一步分析其与气道炎症间可能的联系。

1 材料和方法

1.1 实验动物造模与分组

动物实验全程依据《华中科技大学实验动物管理办法条例》执行。24只清洁级雌性BALA／c小鼠购于华中科技大学同济医学院实验动物学部，鼠龄6周，体重（20±2）g。小鼠随机分为哮喘组、地塞米松干预组、孟鲁司特钠干预组以及正常对照组，每组6只小鼠。哮喘组小鼠参考我科实验室既往方法［4］，即通过卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激发的方法制作哮喘小鼠模型。小鼠在第1天和第8天通过腹腔注射40μg OVA（购于美国Sigma公司）和4.5mg Al（OH）3佐剂，于实验第22天至24天每天以2% OVA 雾化激发小鼠30min。地塞米松干预组在制作哮喘模型同时，于每次激发后腹腔注射地塞米松（1.7mg／kg）干预。孟鲁司特钠干预组在制作哮喘模型同时，于每次激发后灌胃给予孟鲁司特钠500μg（默沙东制药，英国）干预。实验第25天结束，取小鼠右肺中叶做常规石蜡切片，苏木精－伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肺组织病理学变化，以观察模型是否成功。

1.2 支气管肺泡灌洗液的处理

通过气管插管以1mL无菌PBS平衡液反复灌洗鼠肺3次，并回收支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。BALF 以4℃、400g离心5min。收集上清液－70℃保存以备ELISA检测。细胞沉淀重悬后通过瑞氏－吉姆萨染色分类计数各种炎性细胞。

1.3 免疫组织化学法检测cyr61表达

山羊抗小鼠cyr61一抗购于美国Santa Cruz公司，SP 检测试剂盒及DAB 显色剂购于武汉博士德生物工程有限公司。实验步骤参照说明书进行。其中一抗cyr61工作浓度为1∶100，4℃孵育过夜。实验中以无菌生理盐水代替一抗作为阴性对照，以已知阳性片作阳性对照。阳性细胞胞质染色呈棕黄色。采用HMIAS－2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像分析，每张病理切片400倍镜下随机选取10个视野，计数阳性细胞的平均灰度值。

1.4 ELISA法检测BALF中IL－4、IL－17A含量

IL－4和IL－17A 检测试剂盒购于美国R＆D 生物公司，实验参照试剂盒说明书进行。所有样品均采用双复孔检测，计算均值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 哮喘模型的建立

哮喘组小鼠OVA 激发当时即出现明显呼吸急促，行动迟缓。连续激发3d 后，小鼠毛色失去光泽，反应迟钝。病理切片观察发现细、小支气管壁和伴行动脉周围有较多嗜酸性细胞和淋巴细胞浸润，支气管皱襞增多延长，杯状细胞增生明显，平滑肌增厚，管腔缩窄。地塞米松和孟鲁司特组小鼠上述指证均较哮喘组明显减轻（图1）。

图1 不同干预组小鼠肺组织HE染色图片（×100）Fig.1 HE staining analysis of the pathological changes of mouse lung tissues in the different groups（×100）

2.2 各组小鼠BALF中炎性细胞比较

地塞米松和孟鲁司特组来源的BALF 中有核细胞（nucleated cells）总数、嗜酸性粒细胞（eosinophils）以及淋巴细胞（lymphocytes）数无明显差异，较哮喘组明显减少（P＜0.05），但均较正常对照组明显增多（P＜0.05）。见图2。

图2 不同干预组支气管肺泡灌洗液中细胞计数Fig.2 Counts of nucleated cells，eosinophils and lymphocytes in BALF in different groups

2.3 各组小鼠BALF中IL－4和IL－17A蛋白含量比较

通过ELISA 检测发现地塞米松和孟鲁司特组来源的BALF 中IL－4和IL－17A 水平无明显差异，较哮喘组明显降低（P＜0.05），但均较正常对照组明显增高（P＜0.05）。见图3、4。

图3 不同干预组支气管肺泡灌洗液中IL－4蛋白水平比较Fig.3 Comparison of the level of IL－4in BALF in different groups

图4 不同干预组支气管肺泡灌洗液中IL－17A 蛋白水平比较Fig.4 Comparison of the level of IL－17Ain BALF in different groups

2.4 小鼠肺组织中cyr61表达比较

通过免疫组化对cyr61进行检测，发现其主要表达于小气道上皮细胞胞质中。在哮喘小鼠中，其表达明显增强，并且气道周围浸润的炎症细胞中亦有表达。通过灰度值分析进一步发现：地塞米松和孟鲁司特组来源的肺组织中cyr61 表达无明显差异，较哮喘组明显减轻（P＜0.05），但均较正常对照组明显增强（P＜0.05）。见图5、6。

图5 免疫组化检测小鼠肺组织中cyr61的表达（DAB 显色，×200）Fig.5 Immunohistochemistry staining showing the expression of cyr61in the airways of mice in different groups（DAB，×200）

图6 不同组别中cyr61灰度值的比较Fig.6 Comparison of the gray value of cyr61protein in different groups

2.5 小鼠肺组织中cyr61表达与气道炎症间关系分析

通过相关性分析发现，cyr61与BALF中有核细胞总数（r＝0.787 4）、淋巴细胞数（r＝0.726 6）、嗜酸性粒细胞数（r＝0.748 2）、IL－4（r＝0.842 9）以及IL－17A 水平（r＝0.715 7）均呈正相关（均P＜0.05）。

3 讨论

在本实验中，我们通过传统方法，即以OVA 致敏及激发小鼠的方法，制作了以嗜酸性粒细胞肺浸润为主的哮喘小鼠模型。在此基础上，考虑到糖皮质激素和白三烯拮抗剂目前是《全球哮喘防治倡议》所推荐的控制轻度哮喘的一线用药，因而，被选取作为研究哮喘气道炎症变化的干预试剂。

通过免疫组化对cyr61蛋白进行检测，发现其主要表达于小气道上皮细胞的胞质中。在哮喘小鼠中，其表达明显增多，并且气道周围浸润的炎症细胞中亦有表达。在使用地塞米松或孟鲁司特治疗后，哮喘小鼠气道上皮细胞中cyr61蛋白表达均明显减少。在本实验中观察到cyr61在哮喘不同状态下，气道上皮细胞中含量有所变化，这提示cyr61可能参与了哮喘的病理生理过程。

目前研究表明：气道上皮细胞在哮喘的发病机制中扮演着重要角色。气道上皮细胞作为与呼吸道局部外来抗原接触的首道防线，对免疫反应的激活有重要作用。它可以合成并释放多种细胞因子和趋化因子，如IL－25、IL－33、IL－8、CC 型趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）－6以及CCL20等，影响炎症细胞的趋化和功能活化［5－10］。cyr61 表达于气道上皮细胞，因而我们进一步分析它与有核细胞总数、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及炎症因子IL－4和IL－17的相关性。我们发现，cyr61与BALF中有核细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数呈正相关。同时针对性选择Th2细胞炎症的代表性因子IL－4和Th17细胞炎症的代表性因子IL－17A 进行分析，发现cyr61亦与之呈正相关。结合以上的数据和分析，cyr61可能参与了哮喘的气道炎症这一重要病理生理过程。

在既往的研究中，cyr61 被发现参与了肺损伤［11］和肺纤维化［12］的病理生理过程。cyr61 可以与多种细胞粘附分子受体如整合素α2β1，α6β1，αvβ5，αIIbβ3，αMβ2 以及αDβ2 等硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）结合发挥作用［13－15］。cyr61通过p53信号途径活化Bax和细胞色素C诱导纤维细胞凋亡。cyr61还可通过细胞外信号调节激酶（ERK）和核转录因子NF－κB 等信号途径影响细胞合成和分泌。在本实验中，哮喘小鼠气道上皮中cyr61异常增高，分析原因，有可能是通过粘附分子，或是通过影响ERK 或NF－κB，或是通过影响凋亡，或是通过其他途径影响气道炎症。其中的具体环节及可能的机制还有待进一步探讨。

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