线粒体途径在丹参酮 ⅡA诱导人宫颈癌细胞凋亡中作用

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(1 青岛市市立医院检验科，山东 青岛 266011; 2 青岛大学医学院生物化学教研室)

丹参用于治疗冠状动脉疾病和脑血管疾病也有逾千年的历史。从丹参根茎提取的丹参酮ⅡA(TanⅡA)是一种含有醌型结构的脂溶性成分，具有传递电子的作用，表现出多种生物活性[1]。我们的前期研究显示,TanⅡA能降低bcl-2/bax比值，促使HeLa细胞发生凋亡[2]。TanⅡA究竟从何途径促使HeLa细胞发生凋亡目前所知甚少。线粒体通路是细胞凋亡发生的机制之一。本研究观察TanⅡA作用下HeLa细胞发生凋亡的特点，从分子水平揭示TanⅡA所致HeLa细胞凋亡的发生机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

新生牛血清、DMEM培养基为Gibco公司产品。细胞色素C(Cyto C)检测试剂盒购自Biovision公司，化学发光检测试剂盒购自Santacruz公司。线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自碧云天公司。人宫颈癌细胞HeLa细胞株来自中国协和医科大学基础学院细胞中心。TanⅡA来自中国药品生物制品检定所。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养和药物处理 HeLa细胞在含体积分数0.10新生牛血清的DMEM 培养基(含青霉素100 kU/L，链霉素100 mg/L)，体积分数0.05 CO2、37 ℃条件下常规培养，细胞在对数生长期时进行实验，调整细胞密度为2×107/L进行接种。TanⅡA溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成200 mg/L的溶液，过滤除菌保存，实验时用适量的培养液稀释至终浓度1.0、2.0、4.0 mg/L。实验同时设立空白对照组(未加TanⅡA，其他条件完全一致)以及DMSO对照组(DMSO体积分数为0.02)。

1.2.2流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡 TanⅡA处理48 h后收集细胞，在含Annexin V和碘化丙啶(PI)的双标记液中室温孵育20 min后，上流式细胞仪进行检测。用分析软件Cellquest获取数据，计算凋亡率。

1.2.3Western印迹法检测 Cyto C分别提取HeLa细胞细胞质、线粒体蛋白质，定量后行SDS-PAGE凝胶电泳，用电转印仪将蛋白质转印到PVDF膜，转印后的膜依次加入1∶200稀释的一抗、1∶1 000稀释的二抗孵育，化学发光法显色曝光，天能分析软件分析各蛋白条带灰度值，结果以Cyto C/β-actin比值表示。

1.2.4流式细胞仪检测线粒体膜电位 TanⅡA处理48 h后收集细胞，应用JC-1染色液37 ℃孵育20 min后，上流式细胞仪检测，用ModFit V 1.2软件分析。正常细胞的线粒体膜电位电压较高，可形成JC-1的聚集体，发出红色荧光；而线粒体膜电位降低的细胞，则会形成JC-1单体，发出绿色荧光。

2 结 果

2.1 TanⅡA作用后HeLa细胞凋亡情况

以1.0、2.0、4.0 mg/L的TanⅡA作用48 h后，HeLa细胞凋亡率与空白对照组比较，TanⅡA不同浓度组间比较，差异均有显著性(F=987.9，q=10.08～75.38，P<0.01)；而DMSO对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 TanⅡA作用后HeLa细胞Cyto C的变化

与空白对照组相比，TanⅡA各剂量组细胞胞质内Cyto C表达明显增高(F=216.5，q=13.47～29.39，P<0.01)，线粒体内的Cyto C表达则明显降低(F=1 064.6，q=4.11～68.47，P<0.01)；而DMSO对照组与空白对照组比较，差异无显著意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同浓度Tan ⅡA作用后HeLa细胞凋亡率及Cyto C表达比较

2.3 TanⅡA作用后线粒体膜电位的变化

与空白对照组和DMSO对照组比较，1.0、2.0、4.0 mg/L TanⅡA作用HeLa细胞48 h后，正常细胞(线粒体膜电位电压较高)的数量减少，而线粒体膜电位降低的细胞数量增加，差异均有显著性(F=

116.5、116.5，q=5.79～24.56，P<0.01)。另外，DMSO对照组与空白对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 不同浓度Tan ⅡA作用后HeLa细胞线粒体膜电位比较

3 讨 论

多项体外实验结果显示，TanⅡA对乳癌、肺癌、白血病等多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用[3]。本文结果显示，不同浓度TanⅡA作用HeLa细胞能有效地诱导细胞凋亡，凋亡率呈剂量依赖性。抑制细胞凋亡是肿瘤的标志性特征之一，故诱导肿瘤细胞凋亡已成为一种有效的肿瘤治疗的策略与途径[4]。过去人们认为，凋亡主要是由细胞核的改变引起，现在研究显示线粒体是细胞存亡的控制中心[5]，线粒体膜电位降低是凋亡的一个早期事件，在凋亡过程中由于线粒体呼吸链电子传递被中断，产生自由基，影响能量供应，线粒体膜完整性受到破坏，这些都发生在经典的细胞凋亡特征出现以前。我们前期的研究结果显示，TanⅡA能降低bcl-2/bax比值，而在生物系统中，异常表达的bcl-2、bax可能引起细胞线粒体结构的破坏，促使Cyto C释放进入细胞质，最终导致细胞凋亡。此途径也可能参与了TanⅡA诱导HeLa细胞凋亡的过程。

JC-1即四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物，是一种广泛用于检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位的理想荧光探针。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到线粒体膜电位的下降，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件，同时也可以将JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。本实验结果显示，TanⅡA作用HeLa细胞48 h后，线粒体膜电位降低，且呈明显的剂量依赖效应。

Cyto C正常定位于线粒体膜间隙中，不能通过线粒体外膜，因此不能在细胞质中检测到。线粒体结构破坏，线粒体外膜通透性增高，促使Cyto C从线粒体释放到细胞质中。Cyto C从线粒体释放至

胞质是引发凋亡关键步骤。本文研究结果显示，TanⅡA 作用HeLa细胞48 h后，与空白对照组相比，正常细胞(红色细胞)的数量减少，线粒体膜电位降低细胞(绿色细胞)数量增加；细胞胞质内Cyto C表达明显增高，线粒体内Cyto C表达明显降低，并且该作用呈剂量依赖性。

综上所述，TanⅡA能有效地降低HeLa细胞线粒体膜电位，促进Cyto C从线粒体释放到细胞质中，线粒体途径可能是TanⅡA诱导HeLa细胞凋亡的机制之一，但其具体作用机制还有待进一步研究。尽管如此，丹参有希望成为临床治疗肿瘤的辅助用药。

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