RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

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(青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003 1 肿瘤科； 2 中心实验室)

原发性肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，目前早期肝癌主要治疗手段以外科手术为主，但是90%肝癌病人因肿瘤较大或肝硬化而不宜手术。近年来，三维适形放疗(3DCRT)技术大大提高了肝癌的放射剂量，从而提高了肝癌病人的生存率[1-2]。但同时其导致的放射性肝病限制了肿瘤放射剂量的增加。如何提高肝癌的放射敏感性是目前肝癌研究的一个重要方向。survivin基因是一种在肿瘤组织中高特异性表达而在分化正常的组织中沉默的凋亡抑制因子,该基因抑制肿瘤细胞的凋亡并参与血管的生成[3]。survivin基因在肝癌细胞中高选择性表达，与肝癌细胞放化疗抵抗、复发及生存都密切相关，已成为肝癌诊疗的新靶点。RNA干扰技术常用于阻断基因表达。本研究通过构建靶向survivin基因的shRNA真核表达载体并转染肝癌HepG2细胞，探讨其对肝癌细胞放射敏感性影响，为RNA干扰survivin基因治疗肝癌提供可行性依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 胎牛血清为杭州四季青公司产品；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司； Lipofectamine 2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品；OPTI-MEM I优化培养基由Invitrogen公司提供；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)相关试剂购自大连宝生物工程有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司。

1.1.2细胞株 人肝癌细胞株HepG2由我院中心实验室提供，在含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2温箱中,2～3 d传代一次，取对数生长期的肝癌细胞开始实验。

1.2 方法

1.2.1重组质粒的构建 根据RNA设计原则及survivin基因(NM-001168)编码序列，利用BLAST 进行查询，并以前期实验结果为依据[4]，特异性地合成1对针对survivin编码序列的siRNA 片段，并构建survivin基因的重组载体pshRNA-survivin-387，基因靶点位于survivin基因序列第387位点，靶基因的序列为5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′。重组载体两端设有Barn HI或Bbs I酶切位点，以利于与pGPH1-GFP-Neo载体连接。按照实验设计，同时合成阴性对照表达载体pshRNA-survivin-NC及阳性对照表达载体pshRNA-survivin-GAPDH，以上载体均由上海吉玛公司构建。重组质粒转入细胞后可表达绿色荧光蛋白，用荧光显微镜可确定转染效率。

1.2.2细胞分组和转染 转染前24 h,取处于对数生长期的HepG2细胞，传代接种于6孔板，每孔加2 mL无抗完全培养基，使每孔细胞数约5×105个，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养，转染时细胞融合度达70%～90%。分别设置空白对照组(不加液体)、阴性对照组(每孔加入psh-RNA-survivin-NC 4 μg)、siRNA转染组(每孔加pshRNA-survivin-387为4 μg)。每组各设5个复孔，转染过程按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行。质粒与脂质体的比例为1∶2.5(m∶V)。转染后将细胞板置于培养箱中培养，孵育4～6 h后除去复合物，更换培养基，转染24～48 h后于荧光显微镜下计算转染效率。

1.2.3RT-PCR技术检测survivin mRNA水平转染48 h后分别收集3组细胞，调整细胞密度为107/L，采用TrizoL法提取总RNA。RT反应体系为20 μL(包括提取的RNA 2 μL，PrimescriptRTase 1 μL、OligodT 1 μL、dNTP 1 μL和适量5×RTbuffer、氯化镁)，混匀，于PCR仪上行RT反应，反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，终止反应合成cDNA。PCR扩增体系体积为50 μL，反应条件：94 ℃变性30 s；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环。取PCR产物，在含EB的20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳分离后，以凝胶成像系统分析结果。PCR扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游引物序列：5′-TCAAGGACCACCGCATCTCTA-3′，下游引物序列：5′-CCAGCTCCTTGAAGCAGAAGAA-3′。以GAPDH 为内参照。用分析软件进行相对定量分析，survivin mRNA水平以survivin产物量/GAPDH mRNA产物量的比值表示。

1.2.4X线照射 收集siRNA转染组细胞，在6 MV直线加速器下给予6 Gy X线照射，再设置空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组，分别接种于6孔板中，使每孔细胞数为2×109/L，置于培养箱中继续培养48 h。

1.2.5细胞凋亡率的检测 培养48 h后将各组细胞收集到试管中，制备细胞悬液使其细胞数约为1×106个，置体积分数0.70的冰浴预冷乙醇中，4 ℃固定24 h，离心3 min沉淀细胞，去除上清液，加入1 mL冰浴预冷PBS，重悬细胞，再次离心去上清液，每管细胞加入0.5 mL碘化丙啶染色液(含RNA酶)，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37 ℃避光温浴30 min，4 ℃避光保存。用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，激发波长为488 nm，根据DNA含量的分布情况进行细胞凋亡分析。细胞凋亡率=亚二倍峰细胞数/细胞总数×100%。

1.2.6MTT法测定细胞存活分数 取对数生长期的HepG2细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×107/L。将细胞接种于96孔板，每孔加入200 μL细胞，每组设4个复孔，置于培养箱中培养72 h。每孔加入5 g/L的MTT各20 μL，继续孵育4 h，终止培养。离心去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上于490 nm波长处测定各孔吸光度值。细胞存活分数用实验组的平均吸光值与空白对照组的平均吸光值的比值表示。每组试验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 转染效率

48 h后表达绿色荧光蛋白的细胞转染效率为60%～80%。

2.2 各组survivin mRNA水平比较

转染48 h后空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组细胞suvivin mRNA的水平分别为0.319±0.009、0.310±0.007、0.195±0.008，siRNA转染组survivin mRNA水平与空白对照组和阴性对照组比较显著下降，差异有显著性(F=218.931，q=17.73、18.66，P<0.05)；空白组与阴性组比较差异无显著性(P>0.05)。

2.3 各组细胞凋亡率比较

空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率分别为(4.39±0.12)%、(4.31±0.33)%、(9.01±0.33)%、(21.17±0.73)%、(29.52±0.75)%，siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率明显高于其他各组，差异有显著性(F=1 421.83，q=13.81～57.48，P<0.05)；siRNA转染组及X线照射组与空白组、阴性组比较，细胞凋亡率也明显提高(q=17.55～39.10，P<0.05)。

2.4 各组细胞存活分数比较

空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组细胞存活分数分别为(95.25±1.41)%、(92.37±1.37)%、(80.96±0.89)%、(30.84±0.55)%、(19.74±1.13)%，siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于其他各组，差异有显著性(F=2 870.578，q=15.32～72.51，P<0.05)；siRNA转染组及单纯X线照射组细胞存活分数与空白组、阴性组比较也明显降低(q=11.14～73.90，P<0.05)。

3 讨 论

survivin是近年来发现的一种凋亡抑制基因，属于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成员，其在胚胎组织及肿瘤组织中表达。王滋宗等[5]的研究结果表明，Caspase-3基因表达与survivin基因表达呈显著负相关。靳秋月等[6]研究显示，在结肠癌细胞中survivin通过抑制Caspase-3活性，在凋亡途径的下游发挥抗凋亡作用。近年来研究显示，survivin在肝癌组织中大量表达。MORINAGA等[7]研究证实了survivin基因高表达与肝癌发生有密切关系。RNA干扰(RNAi)技术是近年来产生的新兴生物技术，即将目的基因所对应的小分子双链 (dsRNA)导入生物体并导致相应mRNA降解，从而阻断哺乳动物细胞中特定基因表达。与传统基因沉寂疗法相比，其主要优点为特异性强、抑制率高、方法便捷，在实验研究、抗肿瘤基因治疗等方面具有广泛的应用前景。

肝癌在我国发病率较高，其临床特点为病程短、进展快、预后较差，病死率在消化系统肿瘤中居第3位，传统治疗的中远期疗效均不理想。放射治疗作为肿瘤三大常规治疗手段之一，在肝癌治疗中的地位却十分有限，主要原因为放射性肝病限制了肿瘤放射剂量的增加。以往研究提示，survivin在肝癌组织中高选择性表达，该特性为其在原发性肝癌中的治疗靶点作用提供了理论依据。目前大量研究表明，抑制survivin基因表达可促进肝癌细胞凋亡及提高化疗药物敏感性[8]。但对于抑制survivin基因表达对放疗敏感性的研究仍然较少。

本研究通过构建siRNA真核表达载体，转染HepG2细胞并经X线照射后进行细胞效应研究。结果表明，转染pshRNA-survivin-387的HepG2细胞能显著下调survivin mRNA的表达。本研究结果显示，siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于siRNA转染组，细胞凋亡率明显升高，提高了肝癌细胞的放疗敏感性。MEYN等[9]研究显示，肿瘤受单一剂量照射后凋亡指数与放射敏感性呈显著正相关。提示促进肝癌细胞凋亡是siRNA干扰survivin基因表达产生放疗增敏效应的机制之一。因此，本实验为siRNA抑制survivin基因的表达，从而提高肝癌细胞凋亡、提高放疗敏感性提供了理论依据，为肝癌基因治疗与放疗提供了实验基础。

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[4] 杨敬敬,雷炜,于壮. RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖的影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(3):199-121.

[5] 王滋宗,魏煜程,沈毅,等. 非小细胞肺癌组织survivin和Caspase基因表达及其关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(4):319-321.

[6] 靳秋月,陈立军,呼文亮. Caspase-3在survivin反义寡核苷酸诱导人结肠癌细胞HT29凋亡时的表达[J]. 天津医药, 2007,35(9):649-651.

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