T63 增强放疗诱导的鼻咽癌细胞凋亡和G2 /M 期阻滞*

刘 琴， 马志健， 王杜娟， 左应林， 仇 旭，王苏美， 王梦瑶， 王春华， 卜宪章△， 杨惠玲△

(1中山大学中山医学院病理生理学教研室，广东 广州510080;2中山大学肿瘤防治中心放疗科，广东 广州510060;3中山大学药学院，广东 广州510080)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚及中国南部常见的恶性肿瘤［1］，EBV 病毒感染、基因易感性、饮食习惯和环境等因素在其发生发展中具有重要作用。放疗是NPC 治疗的主要方式［2］，但由于辐射抗性所致的放疗后局部复发和远处转移等，严重制约了NPC 患者5 年生存率的提高，治疗后的病人5 年生存率仅达到25%左右，因此，寻找逆转辐射抗性的药物是当前NPC 治疗的关键。

近来研究表明姜黄素(curcumin)可有效地抑制肺癌［3］、食管癌［4］、乳腺癌及肝癌［5］等多种肿瘤细胞的增殖，通过影响信号转导通路与细胞周期阻滞等促使凋亡的发生，提高肿瘤的治疗效果。但由于姜黄素溶解性差，分子结构简单且不稳定，使人体对姜黄素的吸收及生物利用度低［6］，所以增强姜黄素生物活性为目的的衍生物变构研究吸引了国内外药物研发机构和研究人员的关注。T63 是我们改构的姜黄素衍生物之一，初筛表明T63 具有抗肿瘤效应，可通过NF-κB 信号通路抑制肺癌细胞的增殖［7］，但T63 是否具有逆转鼻咽癌辐射抗拒作用及其机制尚未见报道。本文拟采用MTT 法、集落形成实验和流式细胞术检测单独放疗组、药物处理组或放疗药物联合作用组对同源不同辐射抗拒的NPC 细胞CNE-2和CNE-2R 的活性、增殖能力、凋亡和细胞周期的影响，并比较其中差异，以探讨T63 对NPC 细胞的作用及其机制，为寻找促进放疗敏感性和逆转鼻咽癌辐射抗性的药物提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

CNE-2 细胞由中山大学肿瘤防治中心提供，CNE-2R 细胞为本实验室构建的其同源的鼻咽癌辐射耐受细胞株［8］。培养时在含有10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素及0.1 g/L 链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、含5%CO2、饱和湿度细胞培养箱内培养。以2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

2 主要试剂

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI-1640 培养基(Gibco);胰酶(华美生物工程公司);四甲基偶氮唑盐［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT;Sigma］;二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO;上海生工);碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料(Sigma);膜联蛋白(Annexin V)- 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)。

3 方法

3.1 细胞活性检测 细胞培养至对数生长期，根据实验时间(24 h、48 h 和72 h)调整细胞悬液浓度接种到96 孔板中，贴壁后于各实验组再加相应浓度药物，对照组加入单纯培养基。培养不同时间(24 h、48 h 和72 h)后加入20 μL MTT (5 g/L)溶液，继续在培养箱内孵育4 h 后，弃板内液体，每孔加入150 μL DMSO，之后避光置摇床上低速振荡混匀，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长490 nm 测各孔的吸光度，计算CNE-2 和CNE-2R 细胞抑制率和IC50。

3.2 细胞增殖能力检测 细胞培养至对数生长期，接种到6 孔板中(每孔200 个细胞)，贴壁后放疗组用6 Gy 电离辐射(ionizing radiation，IR)照射，药物组用0.1 μmol/L T63 作用，分为对照组、IR 组、T63 组及T63 与IR 联合作用组。之后培养48 h 再弃上清，继续培养8 ～12 d。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养液，用PBS 小心浸洗2次，自然干燥;加固定液1 mL 固定15 min，弃固定液，自然干燥后;加1 mL 姬姆萨染色30 ～60 min;用PBS 洗去染色液，自然干燥。显微镜下计算集落数，以≥50 个细胞作一个集落，每次实验重复3 次。按下列公式计算肿瘤细胞集落形成率:

3.3 细胞凋亡率的检测 细胞培养至对数生长期，接种到6 孔板中(每孔2 ×105个细胞)，贴壁后放疗组用6 Gy IR 照射，药物组用0.1 μmol/L T63 作用，分为对照组、IR 组、T63 组及T63 与IR 联合作用组。之后培养24 h，消化收集细胞，各待检标本保证细胞总数不少于1 ×106个，离心弃上清，用PBS 洗2遍，并用Annexin V-FITC/PI 双染标记液100 μL 重悬，避光染色30 min 后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率并分析。每组实验重复3 次。

3.4 细胞周期分布的检测 细胞培养至对数生长期，接种到6 孔板中(每孔1 ×105个细胞)，贴壁后放疗组用6 Gy IR 照射，药物组用0.1 μmol/L T63 作用，分为对照组、IR 组、T63 组及T63 与IR 联合作用组。之后培养24 h，消化收集细胞，各待检标本保证细胞总数不少于106个，离心弃上清，用PBS 洗2遍，75%乙醇固定，4 ℃过夜。第2 天离心弃上清，PBS 洗2 遍后，用含PI 50 mg/L 和RNA 酶20 mg/L的染色液0.5 mL 在4 ℃下避光染色30 min 后，用流式细胞仪检测细胞周期分布并分析。每组实验重复3 次。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。采用SPSS13.0 进行统计处理，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 T63 增强放疗抑制细胞活性和增殖的作用

MTT 法检测发现随着T63 药物作用浓度的升高，细胞抑制率逐渐增高，细胞活性明显受到抑制;对CNE-2 和CNE-2R 细胞分别作用24、48 和72 h后，细胞抑制率增高，存在时间依赖性和剂量依赖性，见图1A、B。

集落形成实验中发现T63 或IR 单独作用可使集落形成减少，而T63 与IR 联合作用时，CNE-2 和CNE-2R 细胞集落形成率明显降低，分别减少了80.2%和87.0%(P ＜0.05)，见图1C。这表明T63能抑制CNE-2 和CNE-2R 细胞集落形成，且能促进IR 抑制鼻咽癌细胞增殖的作用。

Figure 1. T63 and IR inhibited the viability (A，B)and proliferation (C)of NPC cells. Mean ±SD. n =3. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IR group.图1 T63 和IR 抑制鼻咽癌细胞活性和增殖

2 T63 增强放疗诱导细胞凋亡作用

流式细胞术检测发现T63 或IR 均可单独诱导CNE-2 和CNE-2R 细胞的凋亡(P ＜0.05);单独IR作用诱导对照组细胞的凋亡率为20.0%，而联合T63 处理CNE-2 细胞后，其凋亡率显著升高为28.6%;在CNE2R 细胞中，IR 诱导对照组细胞凋亡率为16.5%，联合T63 后CNE-2R 细胞的凋亡率为40.0%，差异有统计学意义(P ＜0.05);且与CNE-2细胞相比，T63 与IR 联合处理诱导CNE-2R 细胞的凋亡更显著(P ＜0.05)，见图2。

Figure 2. T63 and IR induced apoptosis of NPC cells.Mean±SD. n =3. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs CNE-2 group.图2 T63 和IR 诱导鼻咽癌细胞凋亡

3 T63 增强放疗诱导细胞周期阻滞作用

流式细胞术检测T63 或IR 作用对细胞周期分布的影响。IR 单独作用可诱导CNE-2 和CNE-2R 细胞的G2/M 期阻滞，分别为11.0%和23.9%;与IR单独作用组比，T63 与IR 联合作用诱导CNE-2 和CNE-2R 细胞G2/M 期阻滞更明显，分别为34.8%和45.0%，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图3。

讨 论

Figure 3. T63 and IR induced G2/M arrest in NPC cells.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IR group.图3 T63 和IR 诱导鼻咽癌细胞G2/M 期阻滞

随着肿瘤辐射抗性的研究进展，利用不同细胞或组织作为模型研究，并且避免遗传背景差异和肿瘤组织异质性等对结果的影响已经引起学者们的广泛关注。国内外研究中，有许多研究建立了辐射诱导的辐射抗拒细胞株，包括肺癌细胞H69 和D6 的放射抗拒株(H69SCLCR 和D6-R)［9，10］以及胶质瘤细胞MGR2 的放射抗拒株(MGR2R)等［11］。我们采用爬坡式间隔性大剂量X 线诱导的分割方法照射诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2 得到了具有放射抗性的后代细胞CNE-2R，构建具有相近遗传背景的NPC 辐射抗性对比模型(CNE-2 和CNE-2R)［8］，这为NPC 辐射抗性相关研究提供了理想的对比模型，为进一步研究人鼻咽癌细胞放射抗性的分子机制打下了基础。

姜黄素具有二-芳基庚二烯酮的基本结构，包含了酚醛和β-二酮这2 种分子基团;目前，对姜黄素的改造也主要集中在这2 个活性基团上［12］。已有研究表明姜黄素衍生物B50 和B67 能抑制鼻咽癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡和促进G2/M 期阻滞［13-14］。T63 为本课题组改构的姜黄素衍生物之一，有望超越姜黄素成为毒性较低，生物利用度高，且能逆转辐射抗拒作用和促使肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤药，见图4。T63 作用于CNE-2 细胞的IC50远远小于姜黄素作用的IC50［15］，因此，本文中我们对T63 是否具有放疗增敏作用进行进一步的研究。

Figure 4. Chemical structural formula of T63.图4 T63 的化学结构式

集落形成结果显示T63 处理细胞后，其细胞增殖能力显著降低，并能促进NPC 细胞对放疗的敏感性。研究表明，促进肿瘤细胞凋亡是抗癌药抑制肿瘤生长的作用机制之一［16］，因此，我们用Annexin VFITC/PI 双染后流式细胞术检测药物作用后的细胞凋亡 率，发 现T6 3 或IR 均 可 单 独 诱 导CNE-2 和CNE-2R 细胞的凋亡，且CNE-2 和CNE-2R 细胞被IR和T63 联合作用后凋亡明显增多(P ＜0.05)。

放疗能诱导单链或双链DNA 断裂，导致DNA损伤，诱发细胞周期检查点(checkpoint)的激活，进而诱导DNA 的修复或诱导细胞凋亡。细胞周期的改变对DNA 的损伤修复具有重要影响，抑制DNA的损伤修复可提高细胞对放疗的敏感性。Hartwell等［17］研究发现G2期是DNA 合成后期，主要合成有丝分裂中新细胞形成所必需的物质，它是决定细胞能否顺利进入M 期的关键。部分学者认可G2/M 期阻滞与细胞辐射敏感性增强相关的观点，发现辐射高敏感的细胞株G0/G1期阻滞轻微、甚至缺乏，但却有明显的G2/M 期阻滞［18］。与此相符的是，Pawlik等［19］研究发现，细胞周期与细胞的辐射敏感性相关:G2/M 期细胞的辐射敏感度最高，其次是G1期，S 期的细胞对射线的最不敏感。如果不敏感期的细胞比例增加，那么细胞在放射线照射时更有可能表现出抗拒性，所以促使诱导G2/M 期阻滞是提高肿瘤放疗敏感性的一个重要途径。Cui 等［20］研究发现放疗联合三氧化二砷能明显诱导细胞G2/M 期阻滞，提高食管癌的辐射敏感性。Khafif 等［21］研究发现姜黄素作为潜在的抗癌药物，能诱导细胞G2/M 期阻滞，因此姜黄素能增加鳞状细胞癌对辐射的敏感性。另外，Yan 等［22］研究发现IR 可诱导乳腺癌细胞G2/M 期阻滞，促进细胞凋亡并呈剂量依赖性和时间依赖性。与上述结论一致的是，本实验研究结果也显示IR 处理后细胞出现G2/M 期细胞比例增高;用低剂量T63与IR 联合作用后，T63 能增强IR 诱导G2/M 期阻滞的作用，诱导细胞凋亡，具有逆转鼻咽癌细胞辐射抗拒的作用。

总之，通过T63 对CNE-2 和CNE-2R 细胞对比模型的研究发现，T63 或IR 均可单独使CNE-2 和CNE-2R 细胞的增殖能力抑制，诱导凋亡和G2/M 期阻滞;与T63 或IR 单独作用组比，T63 和IR 联合作用的效果更明显，提示T63 能增加NPC 的放疗敏感性，具有放疗增敏的潜在价值。

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