肝纤维化大鼠肝脏中内质网应激相关分子CHOP 和TRB3 的表达变化*

杜锡潮， 韩 冰， 谢汝佳， 邹 河， 杨 勤

(贵阳医学院病理生理教研室，贵州 贵阳550004)

近年研究显示，肝细胞凋亡是导致慢性肝损伤 肝纤维化的重要因素之一，而持续的内质网应激是导致肝细胞凋亡的重要途径。我们前期研究发现四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导肝纤维化过程中有明显的肝细胞凋亡和内质网应激，表现为肝纤维化组大鼠肝脏内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)表达明显增加［1］。但肝纤维化发生发展过程中内质网应激如何引起肝细胞凋亡，其机制目前尚不清楚。有研究发现，内质网应激相关分子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)和Tribbles 同源蛋白3(Tribbles homolog 3，TRB3)是内质网应激蛋白GRP78 下游的信号分子，在内质网应激介导细胞凋亡中发挥重要作用［2-3］，但目前关于慢性肝损伤肝纤维化形成过程中内质网应激相关分子CHOP 和TRB3 的研究鲜有报道。因此本研究重点观察CCl4致大鼠肝纤维化发生过程中内质网应激相关信号分子CHOP 和TRB3表达的变化，探讨其在肝纤维化发生机制中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要试剂 CCl4(分析纯，成都金山化学试剂有限公司);活化转录因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)和TRB3 多克隆Ⅰ抗(北京博奥森生物技术有限公司);CHOP 多克隆Ⅰ抗和β-actinⅠ抗(Cell Signaling);二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒、SABC(兔IgG)-POD 试剂盒和TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);逆转录试剂盒(Fermentas);2 × SYBR Green I 试剂盒(Applied Biosystems);GAPDH、CHOP和TRB3 引物由大连宝生物科技公司设计合成;TRIzol (100 mL)试剂盒(Invitrogen);组织细胞裂解液和BCA 蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司);ECL 发光试剂(Millipore)。

1.2 动物分组 健康雄性Wistar 大鼠32 只，体重(180 ±20)g。大鼠适应性喂养1 周后随机分为:正常4 周组、正常8 周组、肝纤维化4 周组和肝纤维化8 周组，每组各8 只。

1.3 动物模型建立 新鲜配制40%CCl4植物油溶液，3 mL/kg 皮下注射，每隔3 d 注射1 次造模。分别在实验第4 周末和第8 周末股动脉放血处死相应各组大鼠，取部分肝组织切成3 mm ×1 mm ×1 mm 大小，固定于4%中性甲醛，其余肝组织于－70℃保存，用于real-time PCR 检测和Western blotting检测。

2 方法

2.1 肝组织病理形态学观察 常规石蜡包埋切片，行HE 染色，光镜下观察肝脏病理变化，并参照纤维化分级法［4］进行胶原纤维增生程度半定量分析。

2.2 免疫组化检测CHOP 和TRB3 蛋白表达 采用SABC 法严格按照试剂盒说明书操作。阴性对照以PBS 液代替Ⅰ抗。结果判定:光镜下观察棕黄色染成的细胞为阳性。200 倍下观察不少于5 个视野，记数阳性细胞个数及总细胞数，计算阳性细胞所占百分比(%)。

2.3 Western blotting 蛋白印迹分析 把冻存肝组织剪切成小块装入1.5 mL Eppendorf 管中，称重，按每20 mg 组织加200 μL 的比例加入裂解液，用匀浆器冰上匀浆5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清，严格按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒操作说明测定样品总蛋白浓度。每孔上样60 μg，经10%SDSPAGE 分离，电泳结束后，湿转移法将蛋白条带转移至PVDF 膜上(Millipore)，5%脱脂奶粉TTBS 溶液室温封闭1 h 后，分别加入ATF6 多克隆Ⅰ抗(1∶200)、CHOP 多克隆Ⅰ抗(1 ∶1 000)、TRB3 多克隆Ⅰ抗(1∶100)和β-actinⅠ抗(1∶1 000)置4 ℃冰箱振荡孵育过夜。TTBS 洗膜2 次后，加入HRP 标记的Ⅱ抗(1∶4 000)室温孵育1 h。TTBS 洗膜4 次后，ECL 化学发光试剂于暗室中显影，X 光胶片曝光，所得条带用凝胶图像分析系统扫描分析，目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白的灰度值/β-actin 蛋白的灰度值。

2.4 Real-time PCR 检测CHOP 和TRB3 mRNA 按TRIzol (100 mL)试剂盒(Invitrogen)说明书提取大鼠肝脏的总RNA，采用紫外分光光度法进行质量控制并进行定量，逆转录合成cDNA，反应体系20 μL:总RNA 1 μg，5 ×PCR Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L Oligo(dT)1 μL，RNase inhibitor 1 μL，MMLV 反转录酶1 μL，DEPC H2O 补足体积。反应条件:25 ℃10 min，48 ℃60 min，95 ℃5 min。Real-time PCR 反应体系25 μL:反转录产物2 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1. 0 μL，2 × SYBR Green I 12.5 μL，DEPC H2O 补足体积。反应条件为50 ℃2 min，95 ℃10 min ，95 ℃15 s，60 ℃1 min，最后2 步重复40 个循环。以每例标本组织的目的片段与带内参照片段的循环阈值(Ct 值)的比值作为该标本基因表达的相对数值。GAPDH 上游引物 5'-GGAAGCTTGTCATCAATGG-3'，下游引物5'-CTGTGGTCATGAGTCCTTC-3'，扩增320 bp;CHOP 上游引物5'-CCTCGCTCTCCAGATTCCA-3'，下游引物5'-CTCATTCTCCTGCTCCTTCTCC-3'，扩增条带147 bp;TRB3 上游引物5'-TCAAGTTGCGTCGATTTGTCTTC-3'，下游引物5'-CAGTCATCACACAGGCATCCTC-3'，扩增条带84 bp。

2.5 TUNEL 检测肝脏细胞凋亡 取相应的组织切片常规脱蜡入水，滴加0.01 mol/L TBS 1∶200 新鲜稀释proteinase K，37 ℃消化10 min，0.01 mol/L TBS洗2 min×3 次，滴加标记缓冲液，置于湿盒中，37 ℃标记2 h，0.01 mol/L TBS 洗2 min ×3 次，滴加封闭液，37 ℃封闭30 min，甩掉封闭液，滴加用抗体稀释液1∶100 稀释生物素化抗地高辛抗体，37 ℃反应30 min，0.01 mol/L TBS 洗2 min ×3 次，滴加用抗体稀释液1∶100 稀释SABC-FITC + POD，37 ℃反应30 min，0.01 mol/L TBS 洗5 min×4 次，甘油封片，在荧光显微镜下观察明亮黄绿色为阳性细胞，200 倍下观察不少于5 个视野，记数阳性细胞个数及总细胞数，计算阳性细胞所占百分比(%)。

3 统计学处理

数据用SPSS 19.0 统计软件分析，计量资料以均数±标准差(mean ± SD)表示，均数比较用方差分析，病理学半定量结果采用秩和检验，以P ＜0.01 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠肝脏病理学变化

经HE 染色镜下观察可见，正常组大鼠肝索和肝血窦以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，无胶原纤维增生。肝纤维化4 周组大鼠主要表现为肝细胞脂肪变性，汇管区纤维结缔组织轻度增生。肝纤维化8 周组大鼠肝小叶结构破坏严重，肝索排列紊乱，汇管区纤维结缔组织大量增生，内有较多炎症细胞浸润，胶原纤维向肝实质延伸形成纤维间隔，包绕、分割正常肝组织，部分形成假小叶，纤维化程度较正常对照组明显加重(P ＜0.01)，见图1 和表1。

Figure 1. HE staining of rat hepatic tissues in each group(×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group.图1 各组大鼠肝组织HE 染色结果

表1 各组大鼠肝纤维化程度分级Table 1. Degree of hepatic fibrosis in rats of each group (n=8)

2 免疫组化染色结果

光镜下观察胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。CHOP 和TRB3 蛋白在肝纤维化4 周和8 周组大鼠肝细胞阳性率均较正常组明显增高(P ＜0.01)，肝纤维化8 周组大鼠肝细胞这2 种蛋白的阳性率较4 周组明显降低(P ＜0.01)，见图2、3 和表2。

3 Western blotting 分析结果

各组大鼠肝脏均可检测到ATF6 蛋白，肝纤维化组大鼠肝脏p90ATF6表达量较正常组明显减少(P＜0.01)，p50ATF6 表达量较正常组明显增加(P ＜0.01)，见图4;各组大鼠肝脏均可检测到CHOP 和TRB3 蛋白，肝纤维化4 周和8 周组大鼠肝脏CHOP和TRB3 蛋白表达均较正常组明显增加(P ＜0.01)，肝纤维化8 周组肝脏CHOP 和TRB3 蛋白表达较4周组明显减少(P ＜0.01)，见图5、6。

4 Real-time PCR 检测CHOP 和TRB3 mRNA 表达

各组大鼠肝脏均可检测到CHOP 和TRB3 mRNA 表达，肝纤维化4 周和8 周组大鼠肝脏CHOP 和TRB3 mRNA 表达均较正常组明显增加(P ＜0.01)，肝纤维化8 周组CHOP 和TRB3 mRNA 表达量较4周组略有下降，但差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表3。

Figure 2. The expression of CHOP protein in liver tissues detected by SABC method (DAB staining，×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group.图2 SABC 法检测肝脏CHOP 蛋白表达

Figure 3. The expression of TRB3 protein in liver tissues detected by SABC method (DAB staining，×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group.图3 SABC 法检测肝脏TRB3 蛋白表达

表2 各组大鼠肝脏CHOP 和TRB3 蛋白表达比较Table 2. The expression of hepatic CHOP and TRB3 proteins in each group (%. Mean±SD.n=8)

Figure 4. The expression of ATF6 protein in liver tissues detected by Western blotting. 1:4-week normal group;2:8-week normal group;3:4-week liver fibrosis group;4:8-week liver fibrosis group. Mean ±SD. n =8. ＊＊P＜0.01 vs normal groups.图4 Western blotting 检测肝脏ATF6 蛋白表达

Figure 5. The expression of CHOP protein in liver tissues detected by Western blotting. 1:4-week normal group;2:8-week normal group;3:4-week liver fibrosis group;4:8-week liver fibrosis group.Mean±SD. n=8. ＊＊P＜0.01 vs normal groups;##P ＜0.01 vs 4-week liver fibrosis group.图5 Western blotting 检测肝脏CHOP 蛋白表达

5 TUNEL 检测肝脏细胞凋亡结果

荧光显微镜下观察细胞核呈明亮黄绿色者为凋亡细胞，肝纤维化4 周和8 周组肝细胞凋亡率均较正常组明显增高(P ＜0.01)，肝纤维化8 周组肝细胞凋亡率较4 周组明显降低(P ＜0.01)，见图7。

Figure 6. The expression of TRB3 protein in liver tissues detected by Western blotting. 1:4-week normal group;2:8-week normal group;3:4-week liver fibrosis group;4:8-week liver fibrosis group. Mean ± SD. n = 8.＊＊P ＜0.01 vs normal groups;##P ＜0. 01 vs 4-week liver fibrosis group.图6 Western blotting 检测肝脏TRB3 蛋白表达

表3 各组大鼠肝脏CHOP 和TRB3 mRNA 表达比较Table 3. The expression of hepatic CHOP and TRB3 mRNA in each group (mean±SD.n=8)

讨 论

CHOP 又称生长停滞及DNA 损伤诱导蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)，是一个特异性的内质网应激转导因子，属于CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein，C/EBP)转录因子家族成员［5］。近年来国内外研究结果显示，在正常情况下CHOP 主要存在于细胞浆中且表达量很低，而细胞处于应激状态时，通过IRE1-XBP1 和ATF6 通路可以上调CHOP表达，此外PERK-eIF2α 通路能选择性上调ATF4，通过ATF4 可激活CHOP 及氨基酸代谢、转运及氧化还原反应中的相关基因，导致CHOP 的表达量大大增加［6-8］。使用过表达和CHOP 基因定位突变技术的研究表明，在持续的内质网应激中CHOP 过表达可促进细胞凋亡的发生［9］。

Figure 7. Apoptotic hepatocytes detected by TUNEL staining(×200). A:4-week normal group;B:8-week normal group;C:4-week liver fibrosis group;D:8-week liver fibrosis group. Mean ±SD. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs normal groups;##P ＜0.01 vs 4-week liver fibrosis group.图7 TUNEL 检测肝细胞凋亡

TRB3 是果蝇tribbles 基因的哺乳动物同源蛋白，在啮齿类动物中亦被称为神经元细胞死亡诱导假激酶(neuronal cell death-inducible putative kinase，NIPK)［10］。近年研究发现，在内质网应激信号通路中TRB3 属于下游因子，内质网应激时CHOP 可以与TRB3 启动子区域的一段33 bp 碱基重复序列结合而促进TRB3 基因的表达;抑制CHOP 表达会降低其对TRB3 表达的诱导作用［11］，而不同原因引起的神经细胞内质网应激，细胞内CHOP 和TRB3 表达量明显增加，且与相关细胞凋亡有关［12-13］。此外最近的研究也发现，多种肝脏疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、药物性肝病、急性肝衰竭、肝癌等的发生发展也和内质网应激及其介导的细胞凋亡有关［14］。

目前关于慢性肝损伤肝纤维化过程中内质网应激相关分子CHOP 和TRB3 的研究鲜有报道。本课题组前期研究发现CCl4诱导肝纤维化形成过程中，内质网应激标志性蛋白GRP78 蛋白和mRNA 较正常组明显增加，且随时间延长增加更加显著，提示内质网应激参与了CCl4诱导的慢性肝损伤肝纤维化的形成［1］。本研究中我们发现，肝纤维化4 周组大鼠肝脏有明显的脂肪肝和肝纤维化形成，而肝纤维化8 周组大鼠肝脏纤维化更加明显，有假小叶形成;肝纤维化组大鼠肝脏p90ATF6 蛋白表达量较正常组明显减少，肝纤维化组大鼠肝脏p50ATF6 蛋白表达量较正常组明显增加。此外，肝纤维化大鼠肝组织中CHOP、TRB3 蛋白和mRNA 表达也较正常对照组显著增加，且变化趋势与肝细胞凋亡率一致。据此我们推测，CCl4进入肝细胞后，在肝细胞内代谢过程中产生大量氧自由基，导致肝细胞发生持续的内质网应激，ATF6 从GRP78 上解离，产生约90 kD 的ATF6 单体即p90ATF6［15］，p90ATF6 随后进入高尔基体网腔［16］。在高尔基网腔特异性蛋白酶Site-1 及Site-2(S1P and S2P)作用下，切除p90ATF6 内质网跨膜结构域的附近区域，释放胞浆侧50 kD 的N 端ATF6 即p50ATF6［17］。p50ATF6 被转运至细胞核内，一方面促进GRP78 等分子伴侣表达［18］，增强细胞对内质网应激的耐受能力;另一方面p50ATF6 与CHOP 基因的内质网应激反应元件结合，促进CHOP表达［19］。CHOP 进一步与TRB3 基因上的启动子区域结合诱导TRB3 表达，TRB3 一方面通过负反馈机制抑制CHOP 表达［20］，使得肝纤维化8 周组大鼠肝脏CHOP 和TRB3 蛋白表达量较肝纤维化4 周组明显减少;另一方面TRB3 可能通过抑制Akt 磷酸化间接增加Bax 转运和线粒体膜通透性导致肝细胞凋亡［21］，参与肝纤维化的发生发展。此外本研究还发现虽然与肝纤维化4 周组相比较，肝纤维化8 周组大鼠肝脏CHOP 和TRB3 mRNA 表达量降低不明显(P ＞0.05)，但肝纤维化8 周组大鼠肝脏CHOP 和TRB3 蛋白表达量却比肝纤维化4 周组明显减少(P＜0.01)，造成这种基因和蛋白表达不同步，其原因可能是随着慢性肝损伤肝纤维化发生发展，机体内出现某些抗纤维化机制对CHOP 和TRB3 进行转录后调控，但具体机制还需进一步研究。

综上所述，内质网应激可能通过CHOP 和TRB3促进肝细胞凋亡参与肝纤维化发生发展。

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