针刺足阳明经穴对食源性肥胖大鼠血脂及下丘脑胰岛素受体底物1及其丝氨酸磷酸化活性的影响*

何军锋，严 洁，黄惠勇，李江山，王 超，李路丹，屈娅婷

(湖南中医药大学，湖南长沙410208)

肥胖病发病率逐年上升，预防和治疗肥胖已成为21世纪全球面临的最重大的公共卫生挑战［1］。有研究［2］表明：食源性肥胖与胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)上丝/苏氨酸磷酸化活性增强有关。针灸作为一种治疗单纯性肥胖的方法，蕴育着极大的科学内涵和实践价值。本研究观察了针刺足阳明经穴(四白、天枢、足三里、内庭)对高脂饮食诱导的肥胖大鼠血脂及下丘脑胰岛素受体底物1(IRS1)及其丝氨酸磷酸化(pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639水平)的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物

SD大鼠，雄性，体质量50～70 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：湘医动字第20-002号。

1.2 试 剂

兔抗 IRS1(批号 BF30468)、兔抗 pIRS1-Ser307(批 号 CY30691)、兔 抗 pIRS1-Ser636/639(批 号JP94837)，均购自Cell Signaling Technology;二抗山羊抗兔多克隆IgG抗体(HRP标记)，购自Invitro-gen，批号53HS636V;ECL Plus试剂盒，购自 Millpore，批号 893WU906。

1.3 模型的建立

SD大鼠适应性喂养1周后随机分为空白对照组10只，给予普通饲料(由湖南中医药大学实验动物中心提供);实验组60只，给予高脂饲料［3］(由湖南中医药大学实验动物中心提供)。自由进食饮水，室温21～24℃。每2周称量体质量，记录并进行体质量分析。大鼠肥胖判断标准：凡经高脂饲料喂养12周后，SD大鼠的体质量超过普通饲料喂养大鼠体质量的20%作为实验肥胖大鼠。

1.4 动物分组与干预

SD肥胖大鼠模型建立后，取30只肥胖大鼠，将其随机分为模型对照组、针刺足阳明经穴(针刺组)、针刺非经穴组(非经穴组)，每组10只。针刺组将清醒大鼠固定于特制的装置，取单侧四白、天枢、足三里、内庭穴(隔天交替针另一侧)，局部750 g/L酒精常规消毒后，针入3～5 mm，接通电针仪，频率为10 Hz，强度3 mA，以胡须及肢体微动为度，时间15 min。穴位的定位参照《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位。非经穴组在固定大鼠后选择四白、天枢、足三里、内庭穴旁开非经穴点针刺。空白对照组、模型对照组行抓取固定，不作任何治疗。每天治疗1次，治疗6 d休息1 d，持续4周。

1.5 检测指标

1.5.1 血清生化指标

大鼠取血前需过夜禁食8 h，上午8时取血，准确测量体质量(BW)，内眦静脉采血，应用全自动生化分析仪测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TCH)、极低密度脂蛋白(VLDL)。

1.5.2 蛋白表达

采用Western blot法［4］。-70℃冰箱里取出大鼠下丘脑组织，用细胞裂解液裂解，行超声萃取后测定总蛋白表达。分装后置于-20℃冰箱保持。蛋白经分光光度仪定量后在垂直电泳仪(BIO-RAD)上用等量蛋白质样品经120 g/L SDS-PAGE分离后，转移于PVDF膜(Millipore)上(30 V，1 h)。PVDF膜经100 g/L脱脂奶粉封闭1h后，用体积分数5%牛血清白蛋白(BSA)按1∶1000稀释一抗(CST，Anti rabbit IRS1、Anti rabbit pIRS1-Ser307、Anti rabbit pIRS1-Ser636/639)4℃孵育过夜。次日膜经1×TBST洗涤3次，每次5 min，再用50 g/L脱脂奶粉按照1∶10 000分别稀释二抗(Invitrogen，HRP-conjugated Goat anti rabbit polyclone IgG)，室温孵育1 h，1×TBST充分洗涤后，使用 ECL Plus试剂盒(Millpore)发光显影，胶片曝光，扫描定量各信号条带的相对灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化对比

高脂饮食喂养12周后，模型对照组大鼠体质量达(524.32 ±34.18)g，高于空白对照组与针刺组(P ＜0.05或 P ＜0.01);但与非经穴组对比，差别无统计学意义(P＞0.05)。针刺组大鼠体质量下降，与非经穴组对比，差别有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化对比g，±s

表1 各组大鼠体质量变化对比g，±s

注：与空白对照组对比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与非经穴组对比，△ P ＜0.05。

组 别 n 治疗前 治疗后空白对照组 10 56.12 ±5.18 467.12 ±28.15##△模型对照组 10 58.64 ±6.85 524.32 ±34.18＊＊针刺组 10 59.22 ±7.25 480.23 ±30.75*#△非经穴组 10 55.46 ±4.25 512.45 ±35.25*

2.2 干预后各组TG、TCH及VLDL对比

与空白对照组对比，模型对照组及非经穴组TG、TCH、VLDL均升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。针刺组大鼠TG、VLDL下降，与模型对照组及非经穴组对比，差别有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 干预后各组TG、TCH及VLDL对比mmol·L-1，±s

表2 干预后各组TG、TCH及VLDL对比mmol·L-1，±s

注：与空白对照组对比，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，##P＜0.01;与非经穴组对比，△△ P＜0.01。

TG TCH VLDL空白对照组 10 0.69±0.18##△△ 1.82±0.21##△△ 0.23±0.06##△△组 别 动物数模型对照组 10 1.25±0.34＊＊ 2.29±0.23＊＊ 0.36±0.04＊＊针刺组 10 0.86 ±0.25##△△ 2.11 ±0.21＊＊ 0.22 ±0.06##△△非经穴组 10 1.18±0.29＊＊ 2.15±0.22＊＊ 0.35±0.09＊＊

2.3 各组 IRS1蛋白、pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639水平对比

IRS1蛋白表达由低到高依次为模型对照组、非经穴组、针刺组、空白对照组。模型对照组及非经穴组的IRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639表达增高，与空白对照组及针刺组对比，差别有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 各组IRS1蛋白、pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639水平对比

3 讨论

肥胖是指身体内所含的脂肪组织超出了维持生理正常功能的比例，是一种常见的代谢症候群。高脂饲料喂养大鼠是建立肥胖模型最常用的方法，这与人类单纯性肥胖类似［5］，也与《素问·奇病论》所言“此肥美之所发也。此人必数食甘美而多肥也”不谋而合。高脂饮食可诱导肥胖症，表现为体质量增加和血脂代谢的紊乱，并常伴有胰岛素和瘦素抵抗［5］。

IRS是经典胰岛素信号传导通路上的关键信号分子之一，同时也是反馈调节系统的重要靶点。IRS主要包含两种类型的磷酸化：其一为酪氨酸磷酸化位点的磷酸化及其与PI3K的结合，这是胰岛素刺激葡萄糖转运的关键信号反应过程;其二为丝/苏氨酸磷酸化位点的磷酸化：IRS1包含70多个潜在的丝/苏氨酸磷酸化位点，其磷酸化对胰岛素信号通路的传导主要起负调节作用Ser307和Ser636/639位点主要位于IRS1的酪氨酸磷酸化结合区域，其磷酸化可以阻碍IRS1与胰岛素受体的结合，从而抑制IRS1的酪氨酸磷酸化，阻断胰岛素信号通路传导［2］。研究认为：Ser307和Ser636/639位点磷酸化增强与营养过剩所致肥胖密切相关［6］。

在针刺减肥的研究中，足阳明胃经的穴位天枢、足三里、内庭是最常用的腧穴［7］。我们前期研究表明，足阳明经的四白穴与胃肠运动密切相关且两者传入信息可以在中枢汇聚［8-9］，它可能在肥胖研究中有着重要的作用。因此，本研究中选择足阳明经穴这四个腧穴作为研究对象。龚美蓉等［10］的研究表明：针刺足三里、内庭和中脘，在减肥的同时，可显著上调高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛组织IRS1 mRNA表达。本研究结果表明：针刺四白、天枢、足三里、内庭可显著改善高脂饮食诱导的肥胖，并可有效降低三酰甘油和极低密度脂蛋白;尽管对于IRS1蛋白表达并无显著的提高，却可显著抑制pIRS1-Ser307和pIRS1-Ser636/639，此值得注意。这提示针刺足阳明经穴改善肥胖体质的落脚点，可能在胰岛素受体后信号传导通路中的磷酸化环节以及反馈调节位点。

［1］He JF，Wong SS，Qu YT，et al.Obesity-Related Mechanism of Food Intake Suppression［J］.Journal of Brain Science，2011，36：61-80.

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［7］赵强，冯伟.针灸治疗单纯性肥胖取穴规律的临床研究［J］.天津中医药大学学报，2011，30(2)：95-97.

［8］何军锋，严洁，刘健华，等.胃扩张和针刺大鼠四白传人信息对孤束核神经元放电整合的影响［J］.中华神经医学杂志，2005，4(4)：330-333.

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［10］龚美蓉，徐斌，毛珍，等.针刺对肥胖模型大鼠中胰岛素和胰岛素底物表达的影响［J］.时珍国医国药，2010，21(5)：1243-1245.