五子衍宗丸对糖尿病性白内障小鼠晶状体氧化损伤和多元醇通路的影响*

朱向东，王 燕

(1.甘肃中医学院中医基础理论教研室，甘肃 兰州730000;2.甘肃中医学院方剂学教研室，甘肃兰州730000)

糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)是糖尿病患者致盲的重要原因之一，研究其发病机制，寻找有效的治疗方法是眼科学界需要解决的重大课题之一。现代医学研究［1］认为：DC的发病机制主要包括晶状体蛋白的非酶糖基化学说、渗透损伤学说和氧化损伤学说。近年来研究认为：晶状体多元醇通路的异常活跃也是DC发病的重要机制。中医学认为：肝开窍于目，而肝肾同源，因此，对于老年人因糖尿病引发的白内障宜多从肝肾亏虚论治。五子衍宗丸是治疗肾精亏虚引发的不孕、不育症的经典方，笔者依据中医异病同治的精神，临床用于治疗DC效果显著。本实验研究从氧化损伤和多元醇通路的角度探讨五子衍宗丸治疗DC的作用机制，以期为五子衍宗丸的进一步运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±1)g，标准饲料喂养，均由甘肃中医学院科研实验中心提供。SPF级动物质量合格证号为SCXKC(甘)2004-0006-000020，SPF级实验设施合格证号为SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2 试剂与仪器

D-半乳糖(C6H12O6)，分子量180，上海生化制剂厂产品，批号20030805。100 g/L D-半乳糖溶液的配制方法：准确称取D-半乳糖粉末25 g置于烧杯中，用适量的蒸馏水溶解后转于250 mL容器中，加蒸馏水至刻度，静置后放入冰箱中贮藏备用。五子衍宗丸，北京同仁堂股份有限公司产品，批号2030142，成人口服，1次6 g，1 d 2次(动物用剂量按体表面积法折算)。氯化钠注射液，甘肃扶正制药有限公司产品，批号200010081-1;维生素C片，西安利君精华药业有限责任公司产品，批号20030604。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20060214)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号 20060217)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号20060121)，均由南京建成生物工程研究所提供。JY4001电子天平，上海天平仪器厂产品;UV-9100紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司产品;KDC-2044低速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司产品;裂隙灯、Dionex 4500 I HPIC/HPIC色谱仪，苏州医疗器械厂产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将50只小鼠，随机分为空白对照组、模型对照组、维生素C组、五子衍宗丸预防组和五子衍宗丸治疗组5组，每组10只。造模方法［1］：除空白对照组外，其余4组以左手抓住小鼠，使腹部向上，碘伏消毒后下部，右手将注射针头于左下腹部刺入，使针头向前推进 0.5～1.0 cm，再以45°角穿过腹肌固定针头，缓缓注入100 g/L半乳糖溶液25 mL/(kg·d)。空白对照组以同样方法腹腔注射相应剂量生理盐水。1次/d，造模时间20 d。模型对照组、维生素C组、五子衍宗丸治疗组造模时不给药，五子衍宗丸预防组造模同时以五子衍宗丸水煎剂灌胃预防，剂量为1.875 g/(kg·d)(相当于60 kg成人剂量的5倍)，至造模结束。造模结束后，维生素C组以维生素C水溶剂灌胃治疗，剂量为0.31 g/(kg·d)(相当于60 kg成人剂量的5倍);五子衍宗丸治疗组用五子衍宗丸水煎剂灌胃治疗，剂量为1.875 g/(kg·d)(相当于60 kg成人剂量的5倍)，连续20 d。等效剂量按人与动物体型系数折算［2］，受试动物给药容积均为0.01 mL/g 体质量。

1.4 检测指标

1.4.1 晶状体混浊度

除空白对照组外，其余4组在造模结束后检查晶状体混浊度，然后断头处死模型对照组、五子衍宗丸预防组小鼠，低温条件下快速摘取晶状体并采血;空白对照组、维生素C组、五子衍宗丸治疗组在治疗后检查晶状体混浊度，然后处死，摘取晶状体并采血。

晶状体混浊度按照以下分级标准，共分5级［2］：Ⅰ级，无混浊(晶状体透明清亮);Ⅱ级，较混浊(仅赤道部有空泡);Ⅲ级，明显混浊(空泡扩展到中央);Ⅳ级，核混浊(晶状体只在中央呈现核性白内障);Ⅴ级，整个晶状体完全性白内障。

1.4.2 血糖、血清胰岛素、糖化血清蛋白指数

各实验组小鼠于给药前及给药20 d分别测定血糖(以微量血血糖监测仪检测)和血清胰岛素(以放免测定法测定)，给药20 d以NBT还原反应法测定糖化血清蛋白指数。

1.4.3 晶状体SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量和糖醇含量

取小鼠晶状体组织以冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，称质量后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中加适量生理盐水，在玻璃匀浆器内研磨5 min，以3500 r/min离心10 min，取上清液进行下述指标测定：SOD活力测定，采用黄嘌呤氧化酶法;GSH-Px活力测定，以催化还原型谷胱甘肽GSH的反应速度来表示;MDA含量测定，采用硫代巴比妥酸TBA法。另取晶状体组织以4℃蒸馏水冲洗后，以精密电子天秤称量质量，低温(4℃)下匀浆、高速(3000 r/min)低温离心后，脱蛋白，取上清液用 Dionex 4500 I HPIC/HPIC色谱仪测定晶状体的葡萄糖、果糖、山梨醇含量。

1.5 统计学方法

将所测数据结果按试剂盒说明书相应公式计算，采用SPSS13.0统计分析软件处理。晶状体混浊程度采用Ridit分析法，计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，根据方差齐性采用单因素方差分析(One-Way-ANOVN)。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠晶状体混浊度对比

空白对照组小鼠晶状体未出现混浊，晶状体呈透明清亮。随着半乳糖注射量的积累，在造模结束后，模型对照组小鼠有4只眼睛晶状体出现轻度混浊，6只高度混浊;维生素C组小鼠有5只眼睛晶状体轻度混浊，5只高度混浊;五子衍宗丸预防组有6只眼睛晶状体无混浊，2只轻度混浊，2只高度混浊，保持晶状体透明百分率达60%;五子衍宗丸治疗组有4只眼睛晶状体轻度混浊，6只高度混浊。在治疗后，维生素C组有4只眼睛晶状体无混浊，5只轻度混浊，1只高度混浊;五子衍宗丸治疗组有6只眼睛晶状体无混浊，4只轻度混浊，未检查到晶状体高度混浊的现象。见表1。

表1 各组小鼠晶状体混浊度对比n=10，±s

表1 各组小鼠晶状体混浊度对比n=10，±s

注：因小鼠瞳孔小，无法区别Ⅲ级、Ⅳ级与Ⅴ期级，故将3者合为Ⅲ级统计。

组 别 剂量 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级10 0 0模型对照组 0 0 4 6五子衍宗丸预防组 1.875 g·(kg·d)-1 6 2 2维生素 C 组 0.31 g·(kg·d)-1 4 5 1五子衍宗丸治疗组 1.875 g·(kg·d)-1空白对照组0 6 4 0

2.2 各组小鼠血糖、糖化血清蛋白指数和血清胰岛素对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠血糖、糖化血清蛋白指数升高，胰岛素水平降低，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比，五子衍宗丸治疗组、预防组和维生素C治疗组小鼠的血糖水平和糖化血清蛋白指数均降低，差别有统计学意义(P＜0.01)。与维生素C组对比，五子衍宗丸治疗组两指标降低更为明显 (P＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血糖、糖化血清蛋白指数和血清胰岛素对比±s

表2 各组小鼠血糖、糖化血清蛋白指数和血清胰岛素对比±s

注：与空白对照组对比，＊＊ P＜ 0.01;与模型对照组对比，##P＜ 0.01;与维生素C组对比，△ P＜0.05，△△ P＜ 0.01。

组 别 动物数 血糖/(mmol·L-1) 糖化血红蛋白指数/10 胰岛素/(nmol·L-1)10 4.83 ±1.86 213.3 ±16.23 30.42 ±17.05模型对照组 10 24.86±6.81＊＊ 426.4 ±32.5＊＊ 7.89 ±4.36＊＊维生素 C 组 10 15.68 ±6.12## 335.0 ±32.64## 13.75 ±4.66五子衍宗丸预防组 10 10.15±5.82##△ 271.9±21.11##△ 8.89±7.98△五子衍宗丸治疗组 10 7.40±2.63##△△ 218.7±15.32##△△ 20.88±4.26##△△空白对照组

2.3 各组小鼠晶状体SOD、GSH-Px、MDA对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠晶状体组织SOD、GSH-Px的活力降低，MDA含量升高，差别有统计学意义(P＜0.01、P＜0.05)。与模型对照组对比，五子衍宗丸治疗组、预防组小鼠SOD、GSH-Px活力升高、MDA含量降低，差别有统计学意义(P＜0.05 或 P ＜0.01)。见表3。

表3 各组小鼠晶状体SOD、GSH-Px、MDA对比n=10，±s

表3 各组小鼠晶状体SOD、GSH-Px、MDA对比n=10，±s

注：与空白对照组对比，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;与模型对照组对比 ，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组 别 剂量 SOD/(U·mgprot-1) GSH-Px/(U·mgprot-1) MDA/(μmol·gprot-1)60.52 ±15.17 14.30 ±3.31 6.12 ±0.38模型对照组 0 32.26±10.32＊＊ 8.54 ±1.25＊＊ 8.32±0.36*维生素 C 组 0.31 g·(kg·d)-1 49.86 ±24.88## 11.02 ±2.23## 8.03 ±0.25五子衍宗丸预防组 1.875 g·(kg·d)-1 42.56 ±12.36## 10.58 ±4.82## 7.82 ±0.56#五子衍宗丸治疗组 1.875 g·(kg·d)-1 50.42 ±17.32## 11.89 ±1.25# 6.72 ±0.58空白对照组0#

2.4 各组小鼠晶状体组织糖醇含量对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠晶状体组织中葡萄糖、果糖、山梨醇含量升高 ，差别有统计学意义(P＜0.01)。表明DC小鼠晶状体组织中存在明显的葡萄糖、果糖山梨醇蓄积，其多元醇通路异常活跃。与模型对照组对比，五子衍宗丸治疗组、预防组小鼠晶状体组织中葡萄糖、果糖、山梨醇含量降低，差别有统计学意义(P＜0.01);与维生素C组对比，五子衍宗丸治疗组降低更为明显(P＜0.05)。表明五子衍宗丸能有效抑制DC小鼠晶状体组织多元醇通路的异常活跃。见表4。

表4 各组小鼠晶状体组织葡萄糖、果糖、山梨醇含量对比 μmol·(g·wet)-1，±s

表4 各组小鼠晶状体组织葡萄糖、果糖、山梨醇含量对比 μmol·(g·wet)-1，±s

注：与空白对照组对比，＊＊ P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05 ，##P ＜0.01;与维生素 C 组对比，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01。

组动物数 葡萄糖 山梨醇 果糖空白对照组别10 4.08 ±0.73 3.05 ±1.32 1.86 ±0.31模型对照组 10 16.32±4.88＊＊ 31.49±9.76＊＊ 7.91 ±1.63＊＊维生素 C 组 10 11.01 ±3.18## 17.80 ±5.81## 6.07 ±1.48#五子衍宗丸预防组 10 10.86±3.93## 12.56±4.30##△ 3.41±0.91##△五子衍宗丸治疗组 10 9.67±2.54##△ 9.42±2.67##△△ 2.73±0.79##△

3 讨论

糖尿病性白内障(DC)已成为糖尿病并发症中仅次于视网膜病变的第二大眼病。我国2型糖尿病患者中白内障发病率高达62.37%，且发病率随糖尿病病程延长而显著增加，给糖尿病患者带来巨大痛苦。已经有研究［1］证实：蛋白质的糖基化在糖尿病性白内障的发生中起着关键作用，晶状体氧化损伤、多元醇通路异常也参与DC的发生发展。DC一旦发生，治疗难度大，现代医学除了手术外，无特效药物治疗。近年来中医药防治DC取得了很大进展，尤其是在其发病早期，可通过辨证论治、整体调节而收到较好疗效。五子衍宗丸出自《证治准绳》，由枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子和车前子5味药组成，具有补肾益精的作用［3］。笔者临床运用五子衍宗丸加减治疗DC取得了明显疗效，但其作用机制不明。本实验从氧化损伤和多元醇通路的角度，进一步探讨其防治DC的作用机制。

晶状体的氧化损伤被认为是DC的一个主要激发因素［2］。有研究［2］表明：DC 大鼠晶状体中的VC、SOD及GSH-Px活性明显下降，临床上补充抗氧化剂能有效改善DC;而且氧化损伤的发生与血糖上升有关，血糖水平增高可增加晶状体中的自由基，因此氧化损伤与晶状体抗氧化防御系统的紊乱在DC的发生和发展中起着重要作用。SOD和GSH-Px是公认的机体酶促类自由基防御系统，对清除自由基、保护细胞组织起着重要作用。本实验结果表明：模型对照组小鼠晶状体中MDA含量比空白对照组明显增高，而SOD、GSH-Px活性明显下降，说明DC小鼠晶状体中酶促类自由基防御系统受到明显破坏，抗氧化能力明显降低。五子衍宗丸能显著提高SOD、GSH-Px活力，减少MDA含量，说明五子衍宗丸具有清除氧自由基，抗氧化损伤，维持晶状体抗氧化防御系统平衡的作用。

多元醇通路的异常活跃是DC发病的一个重要机制［3-4］。在正常情况下，晶状体的糖代谢有无氧酵解、有氧酵解、磷酸戊糖旁路和多元醇途径等4种主要形式。其中，通过无氧酵解将葡萄糖转化为乳糖是晶状体糖代谢的最主要形式，提供其所需能量的70%～90%。大约只有5%的葡萄糖经过多元醇通路还原为山梨醇，山梨醇在山梨醇脱氢酶的作用下被氧化成果糖［5］。多元醇通路被激活的原因就是高血糖。当血糖水平明显升高，葡萄糖通过辅助弥散大量进入晶状体，醛糖还原酶被激活，从而激活多元醇通路，大量的葡萄糖转化为山梨醇，进一步转变为果糖，导致山梨醇、果糖在细胞中堆积，细胞内呈高渗状态，致使晶状体水肿，各种营养物质无法进入晶状体内，氨基酸减少，蛋白质被聚合，晶状体产生混浊，引起高渗性损害［5］。本实验结果表明：模型对照组小鼠晶状体组织中山梨醇、葡萄糖和果糖的含量明显增加，说明在DC状态下可能其多元醇通路异常活跃。经五子衍宗丸治疗后，DC小鼠晶状体组织中山梨醇、葡萄糖和果糖的含量明显下降，说明五子衍宗丸具有抑制DC小鼠晶状体组织多元醇通路的异常活跃，从而减轻组织细胞的损伤的作用。另外，实验还观察到，五子衍宗丸在降低DC小鼠的血糖和糖化血清蛋白指数，以及增加血清胰岛素水平方面的作用均明显优于维生素C组。因此，良好地控制血糖水平可能是五子衍宗丸抑制DC小鼠晶状体组织多元醇通路异常活跃的一个重要途径。晶状体混浊度检查结果也与上述结果一致，说明：五子衍宗丸可能是通过减轻小鼠的氧化损伤和抑制多元醇通路异常活跃而延缓或者治疗DC的，其深层次的作用机制有待进一步研究。

［1］李德馨，王思玲，苏德森.白内障的发病机制与药物治疗［J］.沈阳药科大学学报，2002，19(4)：300-307.

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