一种胶原蛋白寡肽促进皮肤胶原蛋白与透明质酸合成的研究

宋 芹，陈封政，颜 军，郭晓强，姚 倩，黄露萍，苟小军

(成都大学中药化学实验室，四川成都610106)

胶原蛋白(Collagen)又称胶原，是真皮的主要组成成分。由于胶原蛋白分子中含有大量的酰胺基团和羟基，具有较强的吸湿性，使皮肤保持饱满充盈［1-3］。随着人们年龄的增长，真皮内的胶原发生降解和老化，分子间会形成不规则的架桥，使皮肤的保湿能力减退，皮肤变得干燥而粗糙。目前，人们常通过补充胶原蛋白达到延缓衰老的美容保健效果，采用生物酶解技术，将其水解成分子量小，透皮吸收性能良好的胶原蛋白寡肽［4］，作为化妆品或功能性食品原料［5-6］。本实验将采用酶法从罗非鱼鱼鳞中提取获得平均分子量小于1000u的胶原蛋白寡肽，分析其分子量分布，考察寡肽对人皮肤成纤维细胞增殖和透明质酸分泌的影响;建立D-半乳糖衰老模型小鼠，考察胶原蛋白寡肽对小鼠真皮中胶原蛋白合成的影响，初步探讨罗非鱼胶原蛋白寡肽在皮肤美容保健方面的功效及作用机制，为化妆品与功能性食品的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼干燥鱼鳞 海南水产品市场;蛋白酶MG

日本天野エンザイム株式会社;复合蛋白酶HHM、胶原蛋白复合酶 日本高研株式会社主席研究员郁小兵博士提供;三氯乙酸，羟脯氨酸等试剂 均为分析纯;人皮肤成纤维细胞 日本北海道大学齿科研究室;α-MEM培养基、胎牛血清 美国 GIBCO公司;青链霉素双抗 美国Invitrogen公司;细胞数测定试剂盒WST-8 kit キシダ化学株式会社;透明质酸测定试剂盒 日本生化学工业社。昆明种小鼠(雄性)，体重25～30g 东京实验动物中心。

LC-9A shimaDZU/C-R7A高效液相色谱仪、UV-1601型紫外分光光度计 日本岛津公司;METTLER-AE100型电子天平 瑞士METTLER公司;Infinite500全自动酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胶原蛋白寡肽(Collagen peptid，简称CP)制备取罗非鱼鱼鳞经HCl脱钙后，在45℃下，采用复合酶(1%MG+1%HHM)酶解12h，灭活后，冷冻干燥，得胶原蛋白寡肽，平均分子量约为920u，10个氨基酸以下的寡肽约占50%，三肽约占12%［4］。取CP适量，溶解于0.9%NaCl溶液中，制成5mg/mL溶液。

1.2.2 CP对人正常成纤维细胞增殖的影响

1.2.2.1 人皮肤成纤维细胞培养 人皮肤成纤维细胞于MEM培养基(含5%胎牛血清)在5%CO2，湿度95%，恒温37℃的二氧化碳培养箱中培养。取96孔板，按每孔1×103个播种细胞。待细胞附着后，各组中分别加入 15、30、60μg/mL CP 溶液 10μL，以加入相同体积PBS缓冲液作为空白对照组。

1.2.2.2 WST-8法测定细胞数 在添加CP溶液后培养细胞72h，从培养箱中取出96孔板，向各孔中加入WST-8溶液10μL，重新放回CO2培养箱中孵育，进行显色反应。4h后取出，在450nm下测定OD值。

1.2.3 CP对人正常成纤维细胞透明质酸分泌的影响取96孔板，按每孔1×103个播种细胞，每3d换液一次。待细胞附着后，各组中分别加入100μg/mL CP溶液10μL，以加入相同体积PBS缓冲液作为空白对照组。培养7d后，按试剂盒说明书测定透明质酸分泌量。

1.2.4 CP对小鼠皮肤胶原蛋白合成的影响 取健康雄性小鼠50只，随机分为正常组、模型组、各CP给药组(125、250、500mg/kg);正常组和模型组给予等体积的CMC-Na;给药同时模型组和各给药组皮下注射 5%D-半乳糖 0.25mL/10g［7］;正常组皮下注射等体积的生理盐水;连续6周，最后1d灌胃和注射D-半乳糖2h后，处死，取小鼠背部皮肤，8%硫化钠脱毛，用脱脂液(氯仿∶乙醇 =2∶1)脱脂24h，取出清洗后真空干燥，取少量放入试管中，各样品加入6mol/L盐酸水解，采用分光光度法［8-10］测定羟脯氨酸(HYP)含量，按胶原蛋白中14%的HYP换算小鼠皮肤中的胶原蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 人皮肤成纤维细胞增殖活性

结果如表1所示，人皮肤成纤维细胞的增殖活性明显强于空白对照组，说明CP对体外培养人皮肤成纤维细胞的增殖活性具有较强的促进作用。

表1 CP对人皮肤成纤维细胞增殖的影响WST-8(±s)Table 1 Effect of collagen oligopeptid on cell proliferation of human skin fibroblast WST-8(±s)

表1 CP对人皮肤成纤维细胞增殖的影响WST-8(±s)Table 1 Effect of collagen oligopeptid on cell proliferation of human skin fibroblast WST-8(±s)

注:与空白对照组比较，“＊＊”表示有极显著差异p＜0.01。

0.278±0.046 CP(15μg/mL) 4 0.762 ±0.065＊＊CP(30μg/mL) 4 0.643 ±0.0825＊＊CP(60μg/mL) 4 0.628±0.0955空白组(PBS)4＊＊

2.2 人皮肤成纤维细胞透明质酸的分泌

结果见图1所示，CP组透明质酸分泌量明显高于空白组，具有显著性差异(p＜0.05)，说明CP对体外培养人皮肤成纤维细胞透明质酸的分泌有显著的影响。

图1 CP对人皮肤成纤维细胞透明质酸分泌的影响Fig.1 Effect of collagen oligopeptid on hyaluronic acid secretion of human skin fibroblast

2.3 小鼠皮肤中胶原蛋白含量

羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特有氨基酸，常以羟脯氨酸的含量换算胶原蛋白含量。通过0、12.5、25、50、100μg/mL五种不同浓度的羟脯氨酸标准样品经氧化脱羧反应生成吡咯，以对二甲氨基苯甲醛显色，测定558nm处的吸光度，以浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程为y=0.0141x+0.0041，r=0.999。结果表明，羟脯氨酸含量在0～100μg/mL之间与吸光度呈良好的线性关系。

各样品于110℃，24h经HCl水解后，羟脯氨酸充分游离。冷却至室温后，在减压条件下，70℃水浴加热，蒸干样品液体，充分除去HCl。往试管中加入5mL蒸馏水，使残留在管壁上的样品充分溶解，取其中溶液0.5mL，加蒸馏水稀释至10mL，经氧化脱羧反应生成吡咯，以对二甲氨基苯甲醛显色，测定558nm处的吸光度A值，代入标准曲线，计算羟脯氨酸含量，并换算胶原蛋白含量，结果如表2。

表2 CP对小鼠皮肤中胶原蛋白合成的影响(±s)Table 2 Effect of collagen oligopeptid on typeⅠcollagen secretion of mouse skin(±s)

表2 CP对小鼠皮肤中胶原蛋白合成的影响(±s)Table 2 Effect of collagen oligopeptid on typeⅠcollagen secretion of mouse skin(±s)

注:“*”表示给药组与模型组相比差异显著，p＜0.05;“##”表示模型组与正常组比较差异极显著，p＜0.01。

正常对照组(PBS)10 63.6±3.2模型组(PBS) 10 58.3±3.7##CP(125mg/kg) 10 69.8±2.9*CP(250mg/kg) 10 68.3±3.7*CP(500 mg/kg) 10 69.1±4.2*

由表2可知，模型组与正常组比较具有极显著差异，说明D-半乳糖所致小鼠皮肤衰老模型表现出明显的胶原蛋白流失。CP给药组与模型组相比，具有显著差异，说明CP能有效缓解应衰老所致的皮肤胶原流失，促进真皮中胶原蛋白的合成。

3 结论

胶原蛋白寡肽是通过生物酶解的方法将胶原蛋白小分子化，获得平均分子量1000u以下的寡肽。由于分子量小，透皮性能好［4］，可用于衰老皮肤胶原蛋白的补充。胶原蛋白寡肽中含甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸等［11］，能对真皮细胞起到营养、保湿的作用，因此具有皮肤美容保养的功效［12-13］。

透明质酸是皮肤和其它组织中广泛存在的天然生物分子，具有极好的保湿作用，能预防和修复皮肤损伤，润滑组织，被认为是理想的天然保湿因子［14-16］。本实验以人皮肤成纤维细胞为研究对象，考察胶原蛋白寡肽对体外培养人成纤维细胞的增殖活性与透明质酸分泌的影响。结果表明，罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽能有效促进人成纤维细胞的增殖与透明质酸的分泌，提示该寡肽有助于恢复衰老皮肤的保湿性能与弹性。通过动物实验，口服胶原蛋白寡肽，能加速真皮中胶原蛋白的合成，说明罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽在开发具有增加皮肤弹性、保湿、抗衰老等特性的功能性食品和化妆品方面具有良好的应用前景。

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