血管细胞黏附分子-1蛋白在人脑胶质瘤组织内表达改变及其临床意义

郭 颖，曲彦明，2，韩 松，钟 洁，于春江，李俊发*

脑胶质瘤是最常见的颅内原发恶性肿瘤，其预后较差，5年生存率不足5%［1］。近年来，随着肿瘤免疫治疗的进展，针对多靶点的分子免疫治疗逐渐成为研究者关注的焦点［2］。既往诸多研究提示，细胞黏附分子表达水平的增高与肿瘤细胞的转移和侵袭密切相关。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)，是免疫球蛋白家族的成员之一，既往关于其在人脑胶质瘤组织中表达水平变化及其作用机制的研究存在分歧。本研究旨在应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹(Western bolt)方法，观察不同病理级别人脑胶质瘤组织中VCAM-1的分布及表达变化情况，研究其与胶质瘤病理分级之间的关系，探讨VCAM-1在胶质瘤组织中表达的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

连续收集北京三博脑科医院神经外科2011年2月至2011年6月间确诊并手术切除的30例人脑胶质瘤标本，所有病例临床资料完整，病理诊断明确。其中男性18例，女性12例，平均年龄(48.1±12.2)岁(最小19，最大68)。病程最短10 d，最长2年，平均为6个月。组织学分型及病理分级严格按WHO(2010年)中枢神经系统肿瘤分类标准，其中Ⅱ级胶质瘤7例，Ⅲ级胶质瘤8例，Ⅳ级胶质瘤15例。Ⅰ级胶质瘤因样本例数少，未列入本次实验的研究对象。另取6例同期非肿瘤患者颅脑外伤行内减压而切除的脑组织标本作为正常对照，1例血管瘤标本作为阳性对照。组织标本均液氮速冻，每个标本的部分组织提取蛋白用于蛋白印迹实验，部分经甲醛溶液固定，制备成石蜡切片后用于免疫组化实验。本研究符合相关伦理委员会规定，所有标本取得均遵循患者及家属知情同意原则。

兔疫源性VCAM-1多克隆抗体(Santa Cruz公司)，鼠源性β-actin抗体(Proteintech Group公司)，增强型放射免疫沉淀检测(RIPA)裂解液(Sigma-Aldrich公司，额外加入2%SDS)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/鼠二抗和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(中山金桥生物技术有限公司);增强型化学发光(ECL)试剂盒(普利莱生物技术有限公司);二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒(Pierce公司);BioMaxMR X线片(Kodak公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学染色:标本取材后，4%甲醛固定液，放入自动脱水机中脱水，液态石蜡包埋组织后切片，梯度水化，置入3%H2O2溶液中，室温15 min，封闭内源性过氧化物酶;弃去H2O2溶液，用磷酸缓冲液(PBS)漂洗3次，每次5 min;用5%羊血清室温下孵育30 min，封闭非特异性抗原的结合位点;移去血清，加入PBS稀释的兔源性抗VCAM-1一抗(1∶200)湿盒内孵育，4℃过夜;次日，回收一抗，用PBS漂洗3次，每次5 min;加入PBS稀释的HRP标记山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育30 min;弃二抗，PBS漂洗3次，每次5 min;加DAB避光显色3～5 min，至显色满意后加入PBS缓冲液漂洗，终止反应;苏木精复染细胞系1～2 min;梯度脱水、透明后中性树脂封片。

结果判断:阳性信号呈棕黄、棕褐色，定位于胞膜和(或)胞质。随机选取10个高倍视野，计数每个视野内的细胞总数和阳性细胞数，所得百分数即为VCAM-1阳性率。

1.2.2 蛋白免疫印迹(Western blot)检测:蛋白样品制备、SDS-聚丙烯酰胺电泳(PAGE)和Western blot参照文献［3－4］。称取收集的脑组织标本0.2 g，剪碎组织，加入PBS漂洗，10 000 r/min离心30 s，弃去含有血液等杂质的上清液，加入100μL裂解液，匀浆器研磨至无肉眼可见碎片(冰上操作)，超声5～6次，10 000 r/min离心1 min，取上清，BCA法测蛋白浓度，定量，配制蛋白电泳样品。取60μg总蛋白上样于10%SDS-PAGE，进行电泳，然后将蛋白转至PVDF膜上。经10%脱脂牛奶封闭1 h后，TTBS漂洗3次，每次10 min。用兔源性抗VCAM-1一抗(1∶200)室温摇床孵育3 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，用TTBS稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温摇床孵育1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min;洗膜后用ECL发光，暗房内X线胶片曝光、显影、定影。在同一张PVDF膜上，TTBS漂洗后，牛奶封闭1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，用鼠源性抗β-actin一抗 (1∶1 000)室温摇床孵育1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，用TTBS稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗(1∶1 000)室温摇床孵育1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min。ECL发光及暗室曝片方法如前所述。所得结果用Gel Doc凝胶成像系统扫描后，应用图像分析软件Quantity one进行吸光度积分值分析。以血管瘤阳性对照组VCAM-1蛋白表达水平为标准，以β-actin蛋白表达量为内参，分别统计分析正常组与脑胶质瘤组、Ⅱ级胶质瘤组与Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组之间VCAM-1蛋白表达水平的差异。

1.3 统计学分析

实验数据用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析(One Way ANOVA)，实验数据以均数±标准差)表示，组间比较采用Bonfferoni检验，数据统计图采用SigmaPlot 10.0绘图软件进行绘图统计。

2 结果

2.1 正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中VCAM-1的表达和分布

正常脑组织中神经细胞未见阳性染色，部分血管内皮细胞VCAM-1染色阳性，在不同病理级别胶质瘤组织内部，出现了不同数量VCAM-1表达阳性细胞，并且随肿瘤病理级别的增高，VCAM-1表达阳性细胞数目明显增多，显著高于正常脑组织 (p＜0.05);Ⅲ级和Ⅳ级恶性胶质瘤与Ⅱ级低级别胶质瘤相比，阳性细胞率亦显著增高(p＜0.05);而两种高级别恶性胶质瘤之间VCAM-1阳性细胞数无显著差异。Ⅲ级和Ⅳ级恶性胶质瘤组织中，VCAM-1阳性细胞多集中分布于肿瘤微血管周围(图1)。

图1 免疫组化结果显示正常脑组织及脑胶质瘤组织内VCAM-1阳性染色细胞数及分布情况Fig 1 Immunohistochemistry results showed the changes in protein expression and distribution of VCAM-1 in normal brain and brain glioma tissue

2.2 正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中VCAM-1表达水平的变化

正常脑组织中，VCAM-1蛋白表达水平较低，而在人脑Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤组织内其蛋白表达量均明显增高(图2～4)(p＜0.05);随着脑胶质瘤恶性程度的提高，VCAM-1蛋白表达水平亦明显增高，即Ⅲ级和Ⅳ级脑恶性胶质瘤组与Ⅱ级胶质瘤相比，VCAM-1蛋白呈现明显高表达(图3)(p＜0.05)，而VCAM-1蛋白表达量在脑胶质瘤Ⅲ级与Ⅳ级间无显著性差异。

图4 不同级别脑胶质瘤组织内VCAM-1蛋白表达量的定量分析结果Fig 4 Quantitative analysis of VCAM-1 protein expression in different grade of cerebral glioma tissue，n=6～15)

3 讨论

脑胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤，尽管采取手术、化疗和放疗等多种治疗手段，复发率依然较高，预后较差。细胞黏附分子是一种跨膜糖蛋白，介导细胞间和细胞与基质间的相互作用。在胚胎发生、免疫应答和炎性反应中发挥重要作用［5］。作为一类重要的细胞黏附分子，VCAM-1(CD106)，分子质量约为110 ku，细胞外含有7个免疫球蛋白样结构域，配体是稳定表达于多数单核细胞表面的 α4β1整合素，即VLA-4［6］。既往研究发现，VCAM-1主要分布在血管内皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面;关于其作用的研究主要集中在免疫炎性反应［7］。既往研究报道，VCAM-1在正常细胞不表达或很少表达，而在肝癌、肾癌、乳腺癌和鼻咽癌等肿瘤组织中异常高表达。关于VCAM-1在脑胶质瘤中表达水平研究结果不一。有研究认为肿瘤细胞通过多种途径刺激血管生成，同时抑制VCAM-1表达，有利于减少免疫细胞浸润，降低局部免疫应答，增强肿瘤细胞免疫逃逸［8－9］。与之相反，另有研究认为胶质瘤细胞本身和血管细胞内VCAM-1表达量增加，有利于肿瘤细胞黏附，促进肿瘤细胞沿血管迁移和侵袭，增强肿瘤细胞免疫逃逸能力［10］。在对C6脑胶质瘤大鼠模型的研究中发现，通过光动力学疗法(PDT)联合抑制VCAM-1的表达相对于单独应用PDT疗法可以更大程度抑制瘤体生长，引起肿瘤细胞凋亡，有效延长动物生存期［11］。在用星形胶质细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤干细胞所构建的大鼠脑胶质瘤模型中，两种动物瘤体大脑皮质及海马等部位均发现VCAM-1与Nestin共表达，并且主要集中分布于肿瘤微血管周围［12］。肿瘤组织内部血管微环境对于肿瘤干细胞的生物学行为有重要的调控作用［13］，提示VCAM-1可能与肿瘤干细胞的作用相关。

通过本实验对所收集的临床脑胶质瘤病理组织的研究，已经获得上述确切的实验结果，证实了VCAM-1蛋白表达与脑胶质瘤病理级别存在一定的相关性。结合既往研究推测，VCAM-1可能通过参与调节肿瘤细胞免疫功能及肿瘤干细胞生物学功能等机制在胶质瘤细胞的恶性进展过程中发挥重要作用，关于其具体的作用机制有待于进一步深入探讨。

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