急进高原后外周血单个核细胞内相关易感基因表达与急性高原反应分析

方盼盼，宫璀璀* ，仓宝成，李正民，李宗杰，李文莉，朱传杰，王迎涛

(1.郑州大学第三附属医院科研中心，河南郑州450052;2.中国人民解放军第153中心医院中心实验室，河南郑州450042)

急性高原反应(acute mountain sickness，AMS)是机体对高原环境的一种应激性反应，是机体的各种功能通过神经体液的调节在新的基础上达到新的平衡过程中所呈现的临床症状。急性高原反应的症状包括头痛、心慌、食欲减退、倦怠、恶心、手足麻木和抽搐等。AMS如早期被发现，症状是可以控制的，但若发现晚，病情则迅速加重，导致脑肺水肿甚至威胁到生命［1］。因此，对AMS进行及时干预非常必要，目前对于AMS的预防尚无较理想的方法和检测手段。本研究观察受试者急进海拔4 000 m高度48 h前后单个核细胞中低氧诱导因子1(hypoxia inducing factor 1，HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和 P38 MAPK 的变化及其与AMS的关系，为AMS的早期防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

反转录试剂盒(Fermentas公司);鼠抗人多克隆抗体和抗鼠二抗试剂盒(Santa Cruz公司);Trizol(Invitrogen公司);PCR试剂盒(Tiangen公司);VEGF、HIF-1α、P38 MAPK以及内参引物(上海生工公司合成)。

1.2 研究对象

某部队赴青海省玉树抗震的官兵30人，其中男性23人，女性7人，年龄22～34岁，乘汽车急行军于24 h内到达海拔4 000 m高度，48 h抵达玉树。出发前和到达玉树48 h后分别采取外周血，以枸橼酸钠抗凝。

1.3 单个核细胞提取

用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，加入5倍体积单个核细胞悬液的预冷的PBS(每毫升PBS中加入磷酸酶抑制剂0.05 mL，以限制进一步的蛋白质修饰)洗涤2次，176×g离心9 min后弃去上清液，加入预冷的PBS将单个核细胞悬液的体积还原至1 mL，计数单个核细胞数量。

1.4 cDNA合成

Trizol 试剂提取RNA，核酸定量仪检测RNA含量。cDNA的合成采用反转录试剂盒，内参管:2μL内参RNA(50 mg/L)、1μL随机引物、4μL 5×缓冲液、1μL RNA 酶抑制剂、2μL 10 mmol/L单脱氧核苷酸混合物、1μL反转录酶、9μL双蒸水;样本管:10μL样本 RNA、1μL随机引物、4μL 5×缓冲液、1μL RNA酶抑制剂、2μL 10 mmol/L单脱氧核苷酸混合物、1μL反转录酶、1μL双蒸水。反转录程序:25℃，5 min;42℃，60 min;70℃，5 min;4℃ 缓冲30 min。

1.5 RT-PCR

以cDNA作为模板，扩增目的基因片段:建立25μL的反应体系:2μL的 cDNA，12.5μL Master-Mix，上下游引物的应用混合液1μL，9.5μL的ddH2O。设计引物:HIF-1α正义引物:5'-AATGA AGTGTACCCTAACTAGCCG-3'，反义引物:5'-GTTC ACAAATCAGCACCAAGC-3';P38正义引物:5'-GTG TCTGTCTTTGTGGGAGGGTA-3'，反义引物:5'-TGGG ATGTTGTCAAGTCTACGC-3';β-actin正义引物:5'-G AGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，反义引物:5'-CCTA GAAGCATTTGCGGTGG-3'。反应条件:95℃(预处理)，5 min;95 ℃(变性)，50 s;55 ℃(退火)，50 s;72℃(延伸)，50 s;35个循环，72℃，5 min;4℃缓冲60 min。以目的基因/β-actin吸光度比值的均值±标准差)表示结果。

1.6 Western blot方法

应用Trizol提取蛋白质，以布拉德福德法测定并调节各组总蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，电泳条件120 V、2.5 h。应用电转仪4℃下转移至硝酸纤维素膜(NCM)上，转膜条件58 V、4 h，将NCM与1∶1 000稀释 的各种一抗室温下反应2 h，再与1∶200稀释的二抗(鼠 IgG-HRP)室温下反应1 h。加入DAB底物溶液，显色20～30 min，同时进行 β-actin的内参照，阳性条带呈现棕色后用水终止反应，应用凝胶成像系统(ALPHA.HP)进行扫描。以目的蛋白/β-actin吸光度比值的均值±标准差)表示结果。

1.7 AMS诊断

根据GB1098291《急性高原反应的诊断和处理原则》对进入玉树高原的官兵进行体检，确诊是否发生急性高原反应。

1.8 统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均值±标准差)表示，采用正态性检验之后进行两配对样本的t检验及相关性分析。

2 结果

2.1 急进海拔4 000 m高度后AMS的发生率

30名官兵中，有18人发生急性高原反应，发生率为60.0%。其中轻度反应者10例，占55.6%;中度反应者5例，占27.8%;重度反应者3例，占16.7%。

2.2 急进海拔4 000 m高度后单个核细胞中HIF-1α和P38 MAPK mRNA表达水平

单个核细胞中HIF-1αmRNA和P38 MAPK mRNA进入高原前(图1A)和高原后(图1B)表达水平符合正态检验，进入高原后两者mRNA分别是1.38±0.31和0.85±0.21显著高于进入高原前的0.46±0.16和0.64±0.11(p＜0.001)。

2.3 急进海拔4 000 m高度后单个核细胞中HIF-1α、VEGF蛋白质的表达水平

单个核细胞中HIF-1α和VEGF(图2)蛋白进入高原前后表达水平符合正态性，进入高原后两者的蛋白表达分别是0.99±0.12和0.765±0.11均显著高于进入高原前的0.84±0.13和0.65±0.10(p＜0.001)。

2.4 急进海拔4 000 m高度后单个核细胞中HIF-1α和VEGF蛋白质表达水平相关性分析

由平原进入高原后HIF-1α和VEGF蛋白质的表达上调，两者呈正相关(p＜0.001)。

2.5 HIF-1α、VEGF和P38 MAPK与AMS相关性分析

HIF-1α和VEGF蛋白表达与AMS发病程度之间呈正相关，相关系数分别为0.875和0.675(p＜0.001);P38 MAPK mRNA表达与AMS发病程度无相关性。

3 讨论

AMS治疗和预防的关键是早期诊断，确诊的时间越早，治疗的成功率就越高［1］。在低氧或无氧状态下，HIF-1不发生羟基化，对缺血或缺氧应激基因进行转录［2］。应用过氧化氢和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可诱导人肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)中HIF-1α mRNA和蛋白质表达水平增加，HIF-1αmRNA的表达峰值出现在2 h，而蛋白质表达峰值出现在4 h，二者之间存在表达时间点的差异［3］。本研究结果显示，在到达海拔4 400 m高度48 h后，虽然 HIF-1α mRNA和蛋白质的表达量均有显著性的增加，但二者之间不存在相关性。HIF-1α蛋白质表达水平与AMS之间存在显著正相关，HIF-1αmRNA与 AMS之间无相关性，是否与表达时间点的不同有关，有待进一步探讨。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和P38 MAPK在低氧状况下的组织或细胞中表达大量增加，低氧是刺激血管重塑、改变细胞通透性、血管再生的最重要因素［4－5］。低氧诱导中性粒细胞凋亡可通过 NF-κB和 P38 MAPK转录调控因子通路介导［6］。用 CoCl2诱导PC12细胞发生低氧应激损伤中，ROS和P38 MAPK磷酸化明显增加［7］。

HIF-1被认为是上调VEGF的主要调节因子［8－10］。在 HIF 的介导下，VEGF mRNA 转录和稳定性增加，且VEGF受体表达上调，VEGF的生物学效应增强［11］。研究发现，VEGF的表达与 P38 MAPK有直接关系。在低氧诱导培养的人内皮细胞中，VEGF的分泌量明显增加，应用P38 MAPK的阻断剂可以阻断VEGF的生成［12］。本研究结果提示VEGF表达水平的增加可能与HIF-1α的调控有关。但是否也存在P38 MAPK的调控作用，或者同时存在HIF-1α和P38 MAPK的共同调控作用而导致VEGF蛋白质的表达水平增加还有待进一步的探讨。

结论，急进高原后HIF-1α、P38 MAPK和VEGF均表达上调，HIF-1α和VEGF蛋白表达水平与AMS发病呈显著正相关，其中VEGF表达水平的增加可能与HIF-1α或与P38 MAPK的调控作用有关。

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