邻硝基苯基靛红查尔酮单用或与抗癌药或抑制剂联用的抗癌活性

戚雨婷，张丽君，赵 翔，张 页*

多种人工合成的查尔酮以及来自药用植物与食物的查尔酮和醌类天然产物，均有显著的抗癌、防癌活性［1－2］。靛红是存在于中药青黛中的芳香酮类化合物，也是人体中的内源性生理活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒及神经保护等多种生物活性［3］。靛红衍生物结构多样，生物活性高，在靶向药物研发领域有很大发展潜力［4］。本实验室将查尔酮与靛红拼接整合，合成了邻硝基苯基靛红查尔酮(o-nitrobenzylisatinyl chalcone，ONIC)。本实验研究了ONIC单用和与多种已知抗癌药和通路抑制剂联用的抗癌效果。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7，人鼻咽癌细胞 CNE，人肺癌细胞 NCI-H460和A549(本实验室液氮罐中保存)。人直肠癌细胞HCT-116和小鼠乳腺癌细胞4T1(上海中科院细胞所)。DMEM及 RPMI-1640培养基(Gibco BRL公司)。特级胎牛血清(北京元亨金马生物技术开发有限公司)。17-AAG、Brefeldin A(布雷菲德菌素A，BFA)、U0126、LY294002 和 Rapamycin(雷帕霉素)(LC Laboratories公司)，Paclitaxel(紫杉醇)、Fasudil(法舒地尔)和Bortezomib(硼替佐米)(大连美仑生物技术公司)，NSC23766(SantaCruz公司)，Metformin(甲福明，即二甲双胍)(北京偶合科技有限公司)。

1.2 细胞培养

将肿瘤细胞用含10%胎牛血清(体积分数)、80 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的 DMEM(或RPMI-1640)培养基、在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，取对数增殖期的细胞用于实验。

1.3 细胞存活率和半数抑制浓度IC50的测定

用酸性磷酸酶(acid phosphatase assay，APA)法检测ONIC作用48 h后的存活细胞相对数量，并计算细胞存活百分率(cell viability，Cv)和半数抑制浓度 IC50(50%inhibition concentration)［5－6］。

1.4 ONIC与已知抗癌药或通路抑制剂联用的效果

联合用药配伍方式:1)将ONIC与药物按一定摩尔比混合后，再用培养液倍比稀释;2)用含固定浓度药物的培养液倍比稀释ONIC;3)用含固定浓度ONIC的培养液倍比或4倍稀释药物。分别将按上述3种方式稀释的配伍药剂作用于96孔板中培养的MDA-MB-231细胞，并以ONIC和各药单独作用于细胞为对照。用APA法测算Cv。药物效应值E、或受累细胞分数Fa(fraction affected)即增殖抑制率可按下式求得:

上述第1种配伍采用Chou氏法［7］联合用药分析软件Calcusyn 2.0，将联用时、以及ONIC与各药单用时各浓度下的Fa值代入软件，计算联合用药指数CI(combination index)，CI＜1两药为协同，CI=1两药为叠加，CI＞1两药为拮抗。用棱镜软件绘制联用时的Fa-CI曲线。两药摩尔比的选取以两药IC50比值为参考，即ONIC和各药均取约4倍IC50值为起始浓度，混合后进行倍比稀释。

上述第2、3种配伍用金正均法计算联合用药的效应-概率和比值 Q［8］:

上式中分子Ea+b为A和B两药联用的效应值;分母为叠加概率和，其中Ea和Eb分别为A药(ONIC)和B药在相同浓度下单用的效应值。当Q=1、并以±0.15为可信区间，即Q在0.85～1.15时，两药叠加;当Q＞1.15，两药协同;当Q＜0.85，两药拮抗。用棱镜软件绘制剂量-Q值曲线。选取存活率约70%、即增殖抑制效应E值约0.3的ONIC或药物浓度为固定值［9］。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 ONIC的体外抗肿瘤活性

ONIC对4种乳腺癌细胞和4种其他肿瘤细胞均有强抗癌活性。其中4T1、MDA-MB-231、MDAMB-468、HCT-116和 CNE细胞对药物敏感性强，MCF-7、NCI-H460和A549细胞敏感性稍弱(表1)。

2.2 ONIC与药物联合作用于乳腺癌细胞的抗癌效果

2.2.1 ONIC与药物按恒定摩尔比稀释的联用效果:ONIC与17-AAG、或ONIC与BFA单独及联合作用于 MDA-MB-231细胞的 Cv曲线如图1，按Chou氏法绘制的Fa-CI曲线如图2，图2A和图2B中的箭头对应于相同的数据点。图1A中箭头显示ONIC与17-AAG联用的Cv值比ONIC或17-AA单用均显著降低(p＜0.001)，此点的联用指数CI=0.603，即有协同作用(图2A)。图1B中箭头显示两种浓度ONIC与BFA联用的Cv值均比单独给药有极显著降低(p＜0.001)，此两点的CI值分别为0.624和0.725，均有协同作用(图2B)。

表1 ONIC作用于8种癌细胞系的IC50值Table 1 The IC50 values of ONIC on eight cancer cell lines，n=6)

表1 ONIC作用于8种癌细胞系的IC50值Table 1 The IC50 values of ONIC on eight cancer cell lines，n=6)

cell line IC50(mg/L)1 mouse breast cancer cell line 4T1 2.1±2.5 2 human breast cancer cell line MDA-MB-231 3.1±2.5 3 human breast cancer cell line MDA-MB-468 3.4±2.6 4 human breast cancer cell line MCF-7 4.6±2.5 5 human colorectal cancer cell line HCT-116 1.9±2.5 6 human nasopharyngeal cancer cell line CNE 2.4±2.6 7 human lung cancer cell line NCI-H460 5.2±2.6 8 human lung cancer cell line A549 9.1±2.5

2.2.2 药物和ONIC浓度恒定的联用效果:在7种药物浓度恒定时，雷帕霉素、17-AAG、U0126与ONIC联用有明显协同;NSC23766或紫杉醇与ONIC之间只有叠加;甲福明和LY294002与ONIC均为拮抗(图3A)。ONIC浓度恒定时，ONIC与17-AAG或硼替佐米均为协同，但与法舒地尔为拮抗(图3B)。

图3 ONIC与抑制剂联用时的剂量-Q值曲线Fig 3 The dosage-Q plots for combination of ONIC and inhibitors

3 讨论

ONIC对体外培养肿瘤细胞有广谱抗癌效果。应用Chou氏和金氏法分析了ONIC与10种药物的联用效果。Chou氏法在国际上广泛应用，其软件适用于按恒定摩尔比稀释的两种联用药物的效果判定，且Chou氏法要求药A与药B对癌细胞均有显著杀伤作用;本研究ONIC有显著抗癌作用，与有强抗癌活性的药物如17-AAG和BFA联用，满足Chou氏法的上述要求。但许多抑制剂如U0126、NSC23766、甲福明、LY294002在其靶标特异性剂量范围内对癌细胞无明显杀伤，无法用Chou氏法计算CI［7］;此时固定抑制剂浓度即可用金氏法获得Q值并判断效果(图3A)。

在10种药物中，紫杉醇和NSC23766与ONIC有叠加作用，即二者的作用途径与ONIC互不干扰。紫杉醇可阻止微管解聚并阻断有丝分裂，但并不影响ONIC的抗癌活性，提示ONIC并非通过干扰微管或有丝分裂发挥作用。Ras-Rac1通路过度活化可引发巨胞饮和鸩亡［10］，NSC23766为 Rac1的抑制剂，但并不拮抗ONIC，提示ONIC并非作用于Rac1上游。与ONIC协同的药物有5种:HSP90抑制剂17-AAG、Arf抑制剂 BFA［11］、蛋白酶体抑制剂硼替佐米、mTOR抑制剂雷帕霉素、ERK1/2抑制剂U0126。17-AAG、BFA、硼替佐米均可能破坏囊泡的稳定性，从而强化ONIC的抗癌效果。与ONIC拮抗的药物有3种:RhoA抑制剂法舒地尔、PI3K抑制剂LY294002、LKB1-AMPK激动剂甲福明。法舒地尔的拮抗作用提示ONIC可活化RhoA通路。LY294002、甲福明、雷帕霉素均可抑制mTOR活化［12］，但前二者与ONIC拮抗、后者则为协同，提示ONIC对mTOR的上、下游通路有关键作用。总之，对ONIC抗癌活性及联合用药特性的揭示，将有助于基于新靶标的抗癌药研发。

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