EphA2在不同肝癌细胞系中过表达及其与乙肝病毒感染相关

王 鹏，朱争艳，李成龙，骆 莹，张海鹏，刘 辉

EphA2是一种受体酪氨酸蛋白激酶，可通过与其配体EphrinAl结合，导致自身及下游底物蛋白的酪氨酸磷酸化，引起一系列生物学效应，参与正常细胞的生长、增殖及转化［1］。研究发现，EphA2受体在多种肿瘤中高表达，这些癌细胞的生长、分化与EphA2的过表达密切相关［2－3］。肝细胞癌(hepatocellular carcinorma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿、进展快、恶性度高，易发生侵袭和转移，传统治疗的效果均不甚理想［4］，探讨HCC的发病及恶化机制，对降低HCC患者的病死率将具有重要意义。因此，本实验通过检测正常肝细胞系及两种肝癌细胞系中EphA2蛋白的表达，探讨其与肝细胞增殖、凋亡的关系，并通过癌细胞中HBV DNA的定量检测，分析EphA2表达与HBV感染的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人正常肝细胞系HL7702及人肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15(中国协和医科大学基础医学研究所提供)。EphA2(clone C-20)兔抗人多克隆抗体(Santa Cruz公司)，免疫组化二抗试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)。HBV DNA定量检测试剂盒(北京达安基因有限公司)。

1.2 细胞培养

将3种细胞系置于DMEM培养液(含10%胎牛血清、青霉素 100 U/L、链霉素 100 g/mL)中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育。待细胞处于对数增殖期时，进行传代培养。

1.3 免疫化学染色

取各组细胞爬片，用4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，加入3%H2O2室温孵育，PBS冲洗，羊血清室温封闭。滴加EphA2一抗工作液(1∶100稀释)，4℃过夜，滴加二抗工作液(1∶200稀释)，室温孵育30 min，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，室温孵育30 min，PBS冲洗后，DAB显色，常规脱水、透明、封片。阴性对照以 PBS液代替一抗。每张切片随机选择200倍视野，经图像分析系统(BioMias，四川大学)测定各组阳性细胞面积。

1.4 Western blot检测

提取细胞总蛋白，经蛋白定量后，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中电泳，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，置于5%脱脂奶粉的Tris-HCl溶液(TBS)中封闭2 h，加入EphA2一抗工作液，4℃过夜。TBS洗膜后，加入二抗工作液，37℃孵育1.5 h，TBS洗膜，加入HRP标记链霉卵白素工作液，室温孵育1 h，TBS洗膜，采用DAB法显色，结果以目的条带与内参条带(β-actin)吸光度的比值表示。

1.5 流式细胞术(FCM)检测

制备单细胞悬液，调整细胞数为1×106个/mL，加入DNA染液，4℃下染色30 min，以500目筛网过滤，上机检测。激发波长488 nm，以凋亡率表示凋亡状态，利用DNA组方图各时相分布的百分比，用增殖指数(proliferation index，PI)表示细胞的增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)，每组实验重复3次。

1.6 HBV DNA含量测定

采用荧光定量PCR法检测两种肝癌细胞中HBV DNA的含量，按照试剂盒说明书操作。目标基因mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 EphA2在各组细胞中的表达

EphA2蛋白阳性表达于胞质与胞膜中，呈棕黄色颗粒，与正常肝细胞中EphA2的染色面积比较，两种肝癌细胞中EphA2的平均吸光度值(累积吸光度值/染色面积，IA/area)显著增大(p＜0.05)，且HepG2.2.15细胞中EphA2的平均吸光度值显著高于HepG2中EphA2的平均吸光度值(p＜0.01)(图1)。Western blot结果显示，与正常肝细胞中EphA2蛋白的表达量比较，两种肝癌细胞中E-phA2蛋白的表达量均显著升高(p＜0.01)，且HepG2.2.15细胞中EphA2蛋白的表达量显著高于HepG2细胞中EphA2蛋白的表达量(p＜0.01)(图2)。

图1 各实验组细胞中EphA2的免疫细胞化学染色结果Fig 1 The EphA2 expression of 3 groups(immunocytochemical staining，×400)

2.2 各组细胞的增殖指数与凋亡率

与正常肝细胞的增殖指数比较，两种肝癌细胞的增殖指数均显著升高(p＜0.01)，且HepG2.2.15细胞的增殖指数显著高于HepG2细胞的增殖指数(p＜0.01)(表1);与正常肝细胞的凋亡率比较，两种肝癌细胞的凋亡率均显著降低(p＜0.01)，且HepG2.2.15细胞的凋亡率显著低于HepG2细胞的凋亡率(p＜0.01)(表1，图3);肝细胞的增殖指数与EphA2表达呈显著的正相关(p＜0.01)，肝细胞的凋亡率与EphA2表达呈显著的负相关(p＜0.01)(图4)。

2.3 肝癌细胞中HBV DNA的含量

图2 各实验组细胞中EphA2的Western blot结果Fig 2 The EphA2 protein expression of three groups

HepG2细胞中 HBV为阴性表达(－)，HBV DNA的含量均为0拷贝/mL;而HepG2.2.15细胞中HBV为阳性表达(+)，HBV DNA的含量均大于1×106拷贝/mL;肝癌细胞中 HBV DNA水平与EphA2的表达量呈显著正相关(r=0.878，p＜0.05)(表2)。

表1 各实验组细胞的增殖指数与凋亡率Table 1 Proliferation index and apoptotic ration of three groups，%)

表1 各实验组细胞的增殖指数与凋亡率Table 1 Proliferation index and apoptotic ration of three groups，%)

*p＜0.01 compared with HL7702;#p＜0.01 compared with HepG2．

group proliferation index apoptotic ratio HL7702 cell line 30.11±0.18 0.311±0.042 HepG2 cell line 32.01±0.16* 0.169±0.013*HepG2.2.15 cell line 34.83±0.28*# 0.103±0.005*#

表2 肝癌细胞中HBV DNA水平与EphA2的表达相关性分析Table 2 The correlation between the expression of EphA2 protein and HBV DNA level

3 讨论

EphA2是一种受体酪氨酸蛋白激酶，在生理条件下以低水平广泛表达于各种上皮细胞中，参与细胞的生长、增殖及转化等。研究发现，EphA2受体在多种肿瘤中高表达，这些癌细胞的生长、分化与EphA2的过表达密切相关［2－3］。EphA2 有望成为一个理想的肿瘤标志物，对多种肿瘤的诊断、治疗及预后判断具有重要的临床意义，但关于EphA2在肿瘤发生及恶性进展中的分子调控机制还需进一步深入研究。

肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，其患病人数正在逐年递增。中国是HCC的高发区，发病率占全球肝癌患者的55%［5］。HCC发病隐匿、进展快、恶性程度高，易发生侵袭和转移，传统治疗的效果均不甚理想，探讨HCC的发病及恶化机制将具有重要意义。研究发现，EphA2在肝癌组织中过表达，可能与肝癌的发生、发展密切相关［6－7］。因此，本实验检测了正常肝细胞系及两种肝癌细胞系中E-phA2蛋白的表达情况，并探讨其与肝细胞增殖、凋亡的关系。结果发现，与正常肝细胞比较，两种肝癌细胞中 EphA2蛋白的表达水平均显著升高，且EphA2蛋白的异常高表达，可促进肝细胞的恶性生长，抑制肝细胞的生理凋亡，提示EphA2蛋白的过表达在肝癌的发生、发展中具有重要作用。

研究发现，乙肝病毒(HBV)感染是引起HBV相关性HCC发病的重要诱因［8］。因此，EphA2蛋白在HCC中的过表达可能与HBV感染具有一定的相关性。本实验通过两种肝癌细胞系中HBV DNA的定量检测，分析EphA2表达与HBV感染的相关性，结果发现HepG2.2.15细胞中HBV DNA水平显著高于HepG2细胞中HBV DNA水平，且HepG2.2.15细胞中EphA2蛋白的表达水平显著高于HepG2细胞中EphA2蛋白的表达水平，HBV DNA水平与E-phA2表达量呈显著正相关，提示在肝癌细胞中E-phA2蛋白的异常高表达与HBV感染密切相关。

［1］Giannoni E，Taddei ML，Parri M，et al．EphA2-m ediated mesenchyma l-amoeboid transition induced by endoth elial progenitor cells enhanc es metastatic spread due to cancerassociated fibroblasts ［J］． J Mol Med，2013，91:103－115．

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［3］Liu Y，Yu CY，Qiu YZ，et al．Downregulation of EphA2 expression suppresses the growth and metastasis in squamous-cell carcinoma of the head and neck in vitro and in vivo［J］．JCancer Res Clin Oncol，2012，138:195 －202．

［4］Su S，Zhou H，Xue M，et al．Anti-tumor efficacy of a hepatocellular carcinoma vaccine based on dendritic cells combined with tumor-derived autophagosomes in murine models［J］．Asian Pac JCancer Prev，2013，14:3109 －3116．

［5］EI-Serag HB，Rudolph KL．Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis［J］．Gastroenterology，2007，132:2557－2576．

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［8］Dimitroulis D，Valsami S，Spartalis E，et al．Hepatocellular carcinoma in patients co-infected with hepatitis C virus and human immunodeficiency virus ［J］．World J Hepatol，2013，5:323－327．