硫化氢对动脉粥样硬化胆固醇代谢的调节作用

周 红，梁小燕，吴志远，戚晓红

(南京医科大学基础医学院1.实验教学中心、2.病理生理学系，江苏南京 210029;3.新加坡国立大学医学院药理学系，新加坡 117597)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是以动脉内膜下脂质沉积、平滑肌细胞和胶原增殖、泡沫细胞形成为主要特征的广泛性动脉病变［1］。高胆固醇血症被认为是导致AS的关键因素，寻找有效的调节体内胆固醇代谢的药物治疗动脉粥样硬化也因此成为这一领域的研究热点［2］。研究显示，硫化氢(hydrogen sulphide，H2S)作为第三种气体信号分子，具有抗炎［3］、抗氧化［4］作用，能抑制细胞黏附分子的表达［5］，阻止巨噬细胞转化为泡沫细胞［6］，抑制氧化型低密度脂蛋白的表达［7］。因此，H2S被认为具有潜在的抗AS作用。然而，H2S是否对脂代谢产生影响还不清楚。本课题通过建立大鼠AS模型，研究H2S对胆固醇代谢的影响，进一步探讨其抗AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康♂ SD大鼠24只，清洁级，体质量(250±10)g，购于江苏省实验动物中心。随机分为3组:对照组(CG)、模型组(MG)和模型+硫氢化钠组(NaHS)，每组8只。实验前，将动物置于实验环境适应7 d。室温(22±2)℃，12 h光照/12 h黑暗，动物自由取食和饮水。

1.2 药品和试剂 NaHS、油红O、对苯二胺硫酸盐购于Sigma公司，胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶购于上海蓝季科技发展有限公司，维生素D3(Vit D3)购于上海通用药业股份有限公司(批号:090903)，TRIzol购于Invitrogen，RT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司，引物由上海生工合成，余试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 Thermo PCR仪，Leica冰冻切片机，日立7600-020全自动生化分析仪，Nikon光学显微镜，美国SONICS超声粉碎仪。

1.4 模型制备与给药方法 采用高脂饲料加Vit D3方法复制大鼠动脉粥样硬化模型。模型组和硫氢化钠组给予高脂饲料(标准饲料配方中加2%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%猪油、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶)，于喂养前和喂养后第3、6、9周腹腔注射Vit D3(3×105IU·kg－1)各1次。同时硫氢化钠组每日腹腔注射 NaHS 56 μmol·kg－1，连续给药 12周。对照组给予普通饲料及腹腔注射生理盐水。

1.5 标本采集 各组动物于喂养前眼眶取血。模型制备完成后，颈总动脉插管取血，3 000 r·min－1离心10 min，分离血清，－80℃保存备用。新鲜肝组织一部分经液氮后－80℃保存，一部分甲醛固定，用于冰冻切片。

1.6 血脂检测 取血清上样于日立全自动生化分析仪检测血总胆固醇(total cholestorol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholestorol，HDL-Ch)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholestorol，LDL-Ch)。1.7 组织学染色 油红O染色:冰冻切片厚10 μm，加入油红O染色液，避光染色60 min，60%异丙醇分化数秒，水洗，苏木精染5～10 s，1%盐水酒精分化1～2 s，自来水洗10 min，风干后明胶甘油封片。

1.8 肝组织胆固醇水平检测 按文献［8］方法取大鼠肝组织匀浆，经氯仿 ∶甲醇(2∶1)稀释、振荡过夜、4 500 r·min－1离心 10 min、通风橱风干、叔丁醇/叔丁基乙醇X-114/甲醇混合液溶解后，全自动生化分析仪测定TG含量。

1.9 HepG2细胞培养 HepG2细胞株培养于含10%胎牛血清、1%双抗(链霉素和青霉素)的DMEM培养基中。于5%CO237℃的培养箱内培养，2～3 d更换1次培养液。取对数生长期的细胞用于实验。NaHS 100 μmol·L－1作用于 HepG2 细胞6 h［5］后用于检测羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(hydroxy-methyl-glutarylcoenzyme A Reductase，HMGCoA Reductase)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)。

1.10 RT-PCR HepG2细胞用灭菌PBS冲洗两次后，按常规方法提取总RNA，并用核酸蛋白测定仪测量RNA浓度及纯度，A260/280比值1.8～2.0。逆转录按试剂盒说明操作。HMGCoA Reductase引物序列为:正义链5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'，反义链5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3';LDLR引物序列为:正义链 5'-CAATGTCTCACCAAGC TCTG-3'，反义链 5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3';内参 GAPDH正义链5'-CCCATCACCATCTTCC AG-3'，反 义 链 5'-ATGACCTTGCCCACAGCC-3'。PCR 反应条件为:98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 1 min，30个循环。将PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶中，电泳后在凝胶成像分析系统中分析目的基因产物条带的灰度值与内参PCR产物条带的比值。

2 结果

2.1 血清血脂水平 血清TC、TG、HDL-Ch和LDLCh含量在喂养前各组间无变化(Tab 1)。喂养12周后，模型组血清TC和LDL-Ch较对照组明显升高(P＜0.01)，HDL-Ch亦升高(P＜0.05);NaHS组血清各指标较模型组降低(P＜0.05)。

Tab 1Lipid levels in blood serum(mmol·L－1，±s，n=8)

Tab 1Lipid levels in blood serum(mmol·L－1，±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

3 months before 3 months after CG MG NaHS TC 2.58±0.24 2.17 ±0.23 2.36±0.31 2.03±0.49 8.49±3.84＊＊ 6.20±3.21 CG MG NaHS#TG 0.83±0.17 0.75 ±0.23 0.73±0.15 1.17±0.50 1.38±0.96 0.47±0.22#HDL-Ch 1.64±0.18 1.41 ±0.15 1.56±0.22 1.12±0.13 1.88±0.68* 1.44±0.28#LDL-Ch 0.62±0.09 0.66 ±0.06 0.67±0.13 0.55±0.09 5.73±2.9＊＊ 3.63±2.92#

2.2 肝组织胆固醇水平 喂养12周后，对照组大鼠肝脏胆固醇含量为每克肝组织(1.65±0.21)mg;模型组为(4.74±0.58)mg，较对照组明显增高(P＜0.01);模型+NaHS组为每克肝组织(3.91±0.40)mg，较模型组降低，差异有显著性(P＜0.01)。

2.3 肝油红O染色 肝油红O染色显示(Fig 1)，与对照组比，模型组肝细胞内红色脂滴明显增多，NaHS组明显改善，仅有轻微脂质。

2.4 HepG2 细胞内 HMGCoA Reductase、LDLR mRNA 的表达 100 μmol·L－1NaHS作用于HepG2细胞6 h后，HMGCoA R的mRNA表达较对照组下降(Fig 2A)，差异有显著性(P＜0.01);而LDLR mRNA的表达较对照组升高(Fig 2B)，差异有显著性(P＜0.05)。

3 讨论

Fig 1 Oil red O staining of hepatic tissues(×100)

Fig 2 Expression of HMG CoA reductase and LDL receptor in HepG2 cells(n=8)

关于H2S对AS的作用已有报道。Wang等［5］研究发现，抑制内源性H2S的产生，可使ApoE敲除鼠动脉粥样硬化斑块增多，而外源性H2S可以缓解AS的病程。有报道H2S对AS有明显保护作用，并能明显下调血脂水平［9］，但其具体机制及作用环节尚不清楚。本实验通过对AS模型大鼠和肝HepG2细胞给予外源性H2S，观察其对胆固醇代谢的影响，并探究其作用机制。本实验结果显示，H2S能降低AS大鼠血清TC、LDL-Ch水平和肝脏TC含量，提示H2S对胆固醇的代谢有一定作用。

人体胆固醇代谢受到胆固醇合成与吸收的双重调节，其来源有两种途径:一种是在关键限速酶HMGCoA Reductase作用下，由 3-甲基-3，5-二羟基戊酸合成乙酰辅酶A，再完成内源性胆固醇生物合成;另外一种途径是外源性的，食物中的胆固醇被小肠上皮细胞吸收后和LDL结合形成复合体，通过和肝细胞膜上丰富的LDL受体结合，完成胆固醇的细胞内吞噬作用。

HMGCoA Reductase是胆固醇合成的限速酶，各种因素对胆固醇合成的调节主要是通过对HMGCoA Reductase活性的影响来实现的［10］。为了探究H2S调节胆固醇合成代谢的机制，我们首先观察了H2S对肝HepG2细胞HMGCoA Reductase的影响。结果显示，H2S能降低HepG2细胞中HMGCoA Reductase mRNA的表达，提示H2S能在转录水平抑制HMGCoA Reductase活性，继而抑制细胞内胆固醇的合成。

胆固醇在体内代谢的主要去路是在肝细胞中转化成胆汁酸。血液中70%的胆固醇由LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)携带，其中90%LDL是通过LDLR途径清除的，肝脏是受体介导的LDL-Ch清除发生的主要场所，约50%的LDL在肝降解。LDLR是一种跨膜糖蛋白，在维持血浆胆固醇水平恒定中发挥重要作用［11］，主要功能是参与LDL的分解代谢，可介导血中2/3的LDL进入肝细胞降解。当LDLR数量减少、结构及功能异常时，血浆胆固醇水平增高，并在组织内过度淤积，最终导致AS斑块形成。

为了探究H2S对胆固醇分解代谢的影响，我们进一步观察了H2S对肝HepG2细胞LDLR的作用。实验发现，H2S能使HepG2细胞中LDLR mRNA的表达增加，提示H2S能增加肝LDLR表达，有助于清除血液中的LDL，降低血液LDL水平。

综上，研究结果显示H2S对AS胆固醇代谢具有调节作用，能抑制肝HMGCoA Reductase表达，使内源性胆固醇合成下降;并上调肝脏LDLR表达，促进胆固醇在肝细胞内的转化，从而降低血浆总胆固醇水平。但H2S影响胆固醇代谢的信号通路和具体的作用环节尚需进一步研究。

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