血管活性肽优洛可定对自发性高血压大鼠血流动力学影响及与L-型钙通道关系研究

李 鑫，张 迪，郑久明，刘新宇，刘春娜*

(1.辽宁医学院药理学教研室，2.锦州市中心医院，辽宁锦州 121001)

高血压一直是心血管系统疾病研究的热点及前沿。近年来，其患病率不断上升且由此引发的心脑血管病致死率的持续增加，使其越来越受到广泛的重视［1］。长期血压增高可致左室心肌产生重构，左室心肌细胞电生理特性也可发生改变。有研究表明，新型神经血管活性肽优洛可定(urocortin，UCN)在心肌缺血/再灌注损伤中对心肌有保护作用，并可明显而持久的降低血压，但确切的机制目前尚不十分清楚［2－3］。为深入研究UCN对心血管疾病的药理作用，寻找安全而有效的治疗高血压、逆转心室重构的药物，本实验主要应用自发性高血压大鼠(SHR)，观察UCN对SHR血流动力学方面、逆转左室重构及相关机制进行研究，从而对UCN在心血管系统中的作用及机制有更深入的了解，为治疗高血压及其他心血管疾病提供新的药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1 动物和药品 健康♂ Wistar Tokyo(WKY)大鼠，及spantaneous hypertension rat(SHR)大鼠，体质量(200±20)g，18周龄，由上海中科院动物研究中心提供。优洛可定，sigma公司(美国)，批号:171543-83-2。

1.2 实验动物分组 实验动物随机分为6组，包括:WKY对照组(WKY);SHR对照组(SHR):Urocortin小剂量组(UCN1)、中剂量组(UCN2)、大剂量组(UCN3);维拉帕米(VER)组。UCN组及VER组均采用 SHR 大鼠 6 只，Urocortin(1、3、6 μg·kg－1·d－1)每日经尾静脉注射给予，VER(10 mg kg－1·d－1)用三蒸水溶解后每日灌胃给予，用药2周。SHR对照组及WKY组每日经尾静脉注射给予生理盐水0.5 ml。给药期间每日监测各组实验动物尾动脉血压变化情况。

1.3 血流动力学测定 给药2周后，各组实验动物以20% 乌拉坦(1 g·kg－1)麻醉，仰卧位固定，测量术前标准Ⅱ导联心电图并存入电脑，分离左颈总动脉，将压力感受器前端塑料引管自近心端插入左心室，记录血流动力学方面指标，包括平均动脉压(AMP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)以及左心室压力最大变化速率(±dp/dtmax)。

1.4 心肌细胞急性分离 血流动力学实验结束后，立即开胸取出心脏，通过主动脉插管把心脏挂在Langendorff灌流装置上，用台氏液灌流大约30 s;之后用无钙台氏液灌流5～7 min使心脏停跳;用Ⅱ型胶原酶消化液消化15 min，并用无钙台氏液快速冲洗心脏3～5 min停止消化，急性分离心肌细胞。

1.5 全细胞膜片钳记录 将上述一半急性分离的心肌细胞用于记录全细胞跨膜L-型钙通道变化情况，保持电压(holding potential，HP)－40 mv，检测电位(test potential，TP)从－40 mV 到 +50 mV，阶跃10 mV，脉宽200 ms，间隔3 s，以平均膜电流与膜电容之比表示其电流密度(Id)，单位为pA/pF。

1.6 自发性高血压大鼠心室肌细胞中荧光钙含量测定 上述急性分离的心肌细胞进行离心，3 000 r·min－1，离心 5 min，弃上清，加入 800 μl普通 PBS缓冲液离心5 min，弃上清，加入300 μl无钙PBS缓冲液离心5 min，再弃去上清，加入10 μl Furo 3，震荡，摇匀，37℃ 水浴15 min之后用流式细胞仪测定心肌细胞内荧光钙含量。

1.7 统计学分析 膜片钳数据采用IGOR软件进行分析。所有数据均以±s表示。两组平均值的比较用非配对t检验。两组以上的均值比较用随机设计的方差分析q检验。

2 结果

2.1Urocortin 对 SHR 大鼠 AMP、LVSP、LVEDP的影响 SHR对照组 AMP、LVSP、LVEDP与 WKY组比较明显升高，二者差异存在显著性(P＜0.01)。与SHR对照组比较，UCN 3个剂量组组和VEA组，AMP、LVSP、LVEDP数值均明显降低 (P＜0.01)。

2.2 Urocortin对自发性高血压大鼠左室压最大变化速率的影响 +dp/dtmax及－dp/dtmax数值是反映左心室收缩功能的主要指标之一。如Tab 1所示，在SHR对照组中±dp/dtmax数值与WKY组比较明显降低。然而，±dp/dtmax数值在WKY组、UCN组以及VER组都明显升高，与SHR对照组比较差异均存在显著性(P＜0.01)。

2.3 UCN对L-型钙通道电流密度影响 与WKY组(3.635±0.156)pA/pF比较，SHR组(5.2967±0.335)pA/pF心室肌细胞L-型钙通道最大电流密度明显升高(P＜0.01)。各UCN组及VER(2.465±0.380)pA/pF组与SHR组相比，L-型钙通道最大电流密度明显降低，其中UCN1组降到(4.271±0.392)pA/pF，UCN2 组为(3.087±0.418)pA/pF，UCN3组抑制最为明显，降低到(2.582±0.205)pA/pF(P＜0.01)，而AST组的电流强度与SHR组比较无明显改变(5.114±0.422)pA/pF(P＞0.01)。

Fig 1 Effects of urocortin on density of SHR cardiomyocytes(±s，n=6)

2.4 细胞内荧光钙含量的测定 流式细胞仪测定急性分离的心室肌细胞内荧光钙含量结果显示，SHR对照组心肌细胞内荧光钙含量(256.1±11.2)mg·L－1明显升高，与 WKY 组(120.5 ±14.4)mg·L－1比较差异存在显著性(P＜0.01)。UCN组与VER组中钙含量与WKY组相近。然而，与SHR对照组相比，UCN 组［UCN1，(151.5±12.5)mg·L－1，P＜0.01;UCN2，(113.3 ±8.7)mg·L－1，P＜0.01;UCN3，(115.6 ±7.3)mg·L－1，P＜0.01］与VER组(95.9±5.4)mg·L－1中荧光钙含量明显降低，差异存在显著性。另外，实验中发现，应用CRF-R2受体阻断剂astressin后，再应用urocortin，并不能降低心室肌细胞内荧光钙含量(205.7±12.8)mg·L－1，与SHR对照组比较差异无显著性(P＞0.01)。

Tab 1Effects of urocortin on hemodynamic index(±s，n=6)

Tab 1Effects of urocortin on hemodynamic index(±s，n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SHR group.

WKY SHR UCN1 UCN2 UCN3 VER AMP 69.75 ±2.18 115.4 ±10.63 104.1 ±9.27 69.87±7.58 70.56 ±8.91 72.46 ±6.96 LVSP 118.0 ±4.7 214.5 ±10.4 171.2 ±12.5 123.7 ±9.4 135.8 ±11.6 140.5 ±9.9 LVEDP 0.67 ±0.11 2.51 ±0.59 1.36 ±0.33 0.74 ±0.14 0.87 ±0.25 0.68 ±0.29+dt/dp 8692±351 5621±407 6059±425 6687±394 7746±453 6643±456－dt/dp －8272±269 －4750±473 －5934±652 －6876±619 －7125±542 －7057±539

3 讨论

本实验选用不同剂量UCN，以观察分析UCN对自发性高血压大鼠血流动力学等方面的影响。实验结果显示，SHR组中AMP、LVSP、LVEDP明显升高，同时+dp/dtmax及－dp/dtmax明显降低，表明血流动力学方面损伤明显。应用不同浓度UCN后，AMP、LVSP、LVEDP明显降低，同时 +dp/dtmax及－dp/dtmax明显改善，提示应用UCN能降低血压，解除心肌组织的超负荷状态，不仅心肌力学性质恢复正常，而且也可能为已发生肥厚的心肌组织提供逆转肥厚的可能。

Fig 2 Contents of fluorimetric calcium in cardiomyocytes in SHR(±s，n=6)

实验中发现，UCN能阻断钙离子内流，降低细胞内和线粒体中钙离子浓度，避免细胞内和线粒体钙超负荷;UCN能有效降低心肌细胞内荧光钙离子含量，逆转大鼠心肌纤维化及心肌细胞内Ca2+超负荷现象。随心肌纤维化和细胞内Ca2+超负荷的逆转，不同浓度UCN用药组大鼠左室舒张、收缩功能均明显改善。研究表明，心肌细胞内Ca2+的平衡取决于细胞外Ca2+通过L-型Ca2+通道进入细胞内的速度和数量以及肌浆网(SR)对Ca2+的摄取、储存和释放，而后者更为重要。SR通过钙泵(SERCA-a)、钙泵调节蛋白—受磷蛋白(phospholamban，PLB)等调节心肌细胞内游离Ca2+浓度，维持细胞内钙稳态和正常心肌收缩、舒张功能［4－6］。研究发现肌浆网钙泵活性降低，与Ca2+亲和力降低，因此可导致Ca2+-ATP酶对胞质内游离Ca2+再摄取功能减低，细胞内 Ca2+超负荷，出现心肌舒张功能障碍［7－8］。在心肌细胞膜片钳实验中发现，UCN 能抑制L-型钙通道开放，是抑制心肌细胞内Ca2+超负荷发生的重要分子机制之一。细胞膜L-型钙通道在细胞兴奋-收缩偶联中发挥重要作用，UCN能够阻断血管平滑肌的L-型Ca2+通道，Ca2+减少后引起血管平滑肌去偶联，而产生扩血管效应，进而降低AMP、LVSP、LVEDP，改善血流动力学。UCN减少钙通道开放，减轻钙超载，从而改善高血压大鼠收缩和舒张功能，同时减轻心室肥厚，在高血压及心血管疾病中起保护作用。UCN作为一种新型的小分子血管活性肽，它通过自分泌和/或旁分泌途径，其作用是广泛的，相应作用机制也较复杂［9－10］，需要在今后的实验中进一步探讨和研究。

综上所述，在自发性高血压大鼠中UCN将血压降至正常水平时，可消退左室肥厚和改善左室收缩及舒张功能，其可能的机制是UCN与相应的CRF-2R结合，通过抑制L-型钙通道开放，降低心肌细胞内钙离子浓度、减轻钙超载，在高血压等心肌疾病中发挥心肌保护作用。

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